4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Проведение санитарно-бактериологического анализа продовольственного сырья, пищевых продуктов, воды и смывов с поверхностей с использованием бактериологического экспресс-анализатора

Методические указания МУК 4.2.581 - 96

Издание официальное

ББК51.23

П78

П78 Проведение санкгарно-6ахтсриоло1мческого а>шюа продовольственного сырья, пищевых продуктов, воды и смывов с поверхностей с использованием бактериологического экспресс-анализатора. Методические указания.-М. Информационно-издательский центр Минздрава России. 1997 -32 с.

ISBN 5—7508—0076—8

1.    Разработаны:

Центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора Медицинского центра Управления делами Президента Российской Федерации: к.м.н 0 П Тулупов, к.м.н. О М Чекмарев, к.м.н. С. В Майков. Н Е. Тулянкина:

Центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора Магаданской области: к.м.н В. Р. Саухкт. Т. А. Каплан. А. А. Гончаренко.

Фирмой “SYRUS SYSTEMS Ltd." к.б.н. Т Б. Макарова, к.м.н С В Юров

2.    Утверждены и введены в действие Первым заместителем Председателя Госкомсдолнд-иаяэора России - Заместителем Главного государственного санитарною врача Российской Федерации 29 октября 19% г

3.    Введены впервые

ББК5Ш

Редакторы Акопова Н Е . Максакова Е И.

Технические редакторы Ханский Р В., Ломанова Е В

Подписано в печать! 1 03.97 Формат 60x88/16    Псч.    .г    2.0

Тираж 500 экз    Заказ    53

ЛР .4? 020877 от 20 05 94 г Министерство здравоохранения Российской Федерации 101431. Москва. Рахмановский пер . д. 3

Оригинал-макет подготовлен к печати и тиражирован Информационно-издательским центром Минздрава России 125167. Москва, проезд Аэропорта. 11

О Информационно-издательский центр Минздрава России

! I

12

4. Протоколы исследований основных групп санитарно-значимых микроорганизмов с использованием бактериологического экспресс-анализатора “РЭБИТ”

Процедура проведения анализа с использованием бактериологического

анализатора “РЭБИТ”:

4.1.    Общие положения

4.2.    Приготовление образца

4.1.1.1.    Жидкие образцы, такие как вода, молоко, фруктовые соки, не требуют специальной подготовки, хотя могут быть сделаны разведения, описанные ниже. Твердые образцы требуют гомогенизации и разведения.

4.1.1.2.    Чтобы приготовить твердый образец в гомогенном виде, необходимо: сделать навеску 10 или 25 г образца в стерильном пакете для гомогенизатора типа Stomacher. Добавьте стерильный разбавитель (обычно Maximum Recovery Diluent - MRD или физиологический раствор, ЗФР) так, чтобы общий вес образца был 100 или 250 г (разведение 1 : 10) и помесгите пакет с образцом и разводящей жидкостью в гомогенизатор. Гомогенизируйте образец.

4.1.1.5. Небольшое количество образца может быть подвергнуто разведению при помещении 1 г образца в стерильные стандартные флаконы с 9 мл стерильной разводящей жидкости.

Если необходимо дальнейшее разведение, то оно может быть сделано серийным титрованием при пипетировании 1 мл из предварительного разведения в 9 мл стерильного разбавителя (обычно MDR) и перемешиванием (например, с помощью Vortex Mixer).

4.1.2.    Исследования на анализаторе “РЭБИТ"

4.1.2.1. Два типа исследований возможно использовать на системе “РЭБИТ*:

13

•    прямой метод, когда питательная среда и образец добавляются непосредственно в стерильную измерительную ячейку с рабочим объемом

2—10 мл;

•    непрямой метод, когда культуральная среда и образец добавляются в стерильную боросиликатную стеклянную пробирку с рабочим объемом до 5 мл. Стеклянная пробирка затем помещается в измерительную ячейку, которая затем плотно закрывается.

4.1.2.2.    Приготовление ячеек для непрямого метода описано в приложении.

4.1.2.3.    При проведении исследований на анализаторе “РЭБИТ” рекомендуется в качестве положительного контроля включать референс-штаммы микроорганизмов. Данные микроорганизмы должны быть выращены в бульонной культуре и серийно разведены в MRD до 10*. 1 мл из наибольшего разведения добавляется в измерительную ячейку с питательной средой и инкубируется в модуле анализатора “РЭБИТ” с исследуемыми образцами.

4.1.2.4.    Каждое исследование на анализаторе “РЭБИТ” должно включать контрольную ячейку со стерильной питательной средой (отрицательный контроль).

4.1.2.5.    После установления в модули анализатора “РЭБИТ” ячеек с исследуемыми образцами, положительным и отрицательным контролями, ячейки инкубируются в модулях в соответствии с заданным Кодом Исследования, описанным ниже.

4.1.2.6.    Типичные Коды Исследования представлены в п. п. 4.1.2.7. и привязаны к специфическим видам исследования, описанным ниже.

41.2.2. Типичные Коды Исследования для системы РЭБИТ

14

4.2. Процедуры специфических методов исследования на анализаторе “РЭБИТ”

4.2.1.    Определение общей микробной обссмененности (ОМЧ)

4.2.1.1.    Для молока и свежих пищевых продуктов с высоким или промежуточным уровнем влажности должен быть использован прямой метод.

4.2.1.2.    Приготовьте образцы, как указано в разделе 4.1.1.

4.2.1.3.    Добавьте 1 мл приготовленного образца в измерительную ячейку с 4 мл среды W1B.

4.2.1.4.    В качестве референс-штаммов используйте Е. coli или S. aureus.

4.2.1.5.    Инкубируйте в модуле анализатора “РЭБИТ" в соответствии с Кодом Исследования ?.

4.2.1.6.    Для сухих и большинства других типов образцов должен быть использован непрямой метод.

4.2.1.7.    Приготовьте образцы в соответствии с разделом 1.1.

4.2.1.8.    Добавьте I мл образца к 4 мл TSB или СВ в 5-мл пробирку для непрямого метода.

4.2.1.9.    В качестве референс-штаммов используйте E.coli или S.aureus.

4.2.1.10.    Инкубируйте в модуле анализатора “РЭБИТ” в соответствии с Кодом Исследования 9.

4.2.1.11.    Оба описанных метода при построении калибровочной кривой должны быть сравнены с результатами классического метода на чашках с использованием РСА (питательный агар).

* Пример построения калибровочного файла, сформированного при исследовании обсемененности .молоко

Пробы молока были исследованы на общую обсемененность (МАФАМ) классическим методом в соответствии с ГОСТом 9225-84 “Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.” Параллельно, соответствующие образцы молока без предварительного разведения были исследованы на анализаторе “РЭБИТ” в соответствии с вышеупомянутым протоколом. Результаты классического метода (КОЕ/мл) и данные, полученные на анализаторе “РЭБИТ” (время определения - в часах и минутах) были внесены в память компьютера “РЭБИТ”. Данные представлены в таблице 2.

На основании введенных данных автоматически анализатором “РЭБИТ” строится количественная зависимость между данными классического метода и результатами, полученными на анализаторе. Данные представлены на рис. 1.

Калибровочному графику оператор присваивает имя, идентичное имени кода исследования для молока, например, FI02TC.

15

После сохранения данных в последующей работе при исследовании молока оператор выбирает код исследования с именем FI02TC, после чего анализатор “РЭБИТ” автоматически, при обнаружении роста, выдает концентрацию МАФАМ в образце.

Более подробно построение и использование калибровочного файла изложено в “Бактериологическом анализаторе “РЭБИТ”. Инструкция пользователя.” М., 19%.

Таблица 2

Результаты сравнительной оценки данных, полученных на анализаторе “РЭБИТ", и классическим методом при определении уровня общей обсемененности молока

Примечание:

CbU/ml - количество колон не образующих единиц (КОЕ) в I .ил исследуемого вещества;

НИ ММ - время регистрации (часы мин) роста иикрооргантиов, определенных анализатором "РЭБИТ¹;

Е - показатель степени

СОДЕРЖАНИЕ

1.    Область применения.....................................................................................4

2.    Общие положения..........................................................................................5

3.    Определяемые с помощью бактериологического экспресс-анали

затора “РЭБИТ" микробиологические показатели по отдельным группам пищевых продуктов,    воды и смывов.........................................7

4.    Протоколы исследований основных групп санитарно-значимых

микроорганизмов...........................................................................................13

4.1.    Обшие положения......................................................................................13

4 11. Приготовление образца..........................................................................13

4.1.2 Исследования на анализаторе 'РЭБИТ",............................................. 13

4.2.    Процедуры специфических методов исследования на анализаторе

“РЭБИТ”......................................................................................................14

4.2.1    Определение общей микробной обсемененности (ОМЧ)...................14

4.2.2.    Определение колиформных бактерий...............................................18

4 2.3    Определение энтеробактерий...............................................................18

4.2.4    Определение Грам(-)-6актерий.........................................................18

4 2.5.    Определение псевдомонад...................................................................19

4.2.6.    Определение анаэробных микроорганизмов.................................19

4.2.7.    Определение дрожжей и плесеней........................................................19

4.2.8 Скрининговое определение сальмонелл в соответствии с Британский стандартным методом .......................................................20

4 2.9 Скрининговое определение сальмонелл - альтернативный метод............21

4 2.10. Определение Staphylococcus aureus.......................................................21

4 2.II. Скрининговое определение E.coli...........................................................22

4.3.    Запись результатов исследования.............................................................22

4.4.    Интерпретация результатов исследования...............................................23

4.5.    Примеры протоколов исследований на анализаторе

“РЭБИТ*......................................................................................................25

5.    Инструкция по приготовлению питательных сред.................................29

6.    Приложение.....................................................................................................31

6.1.    Методы обработки измерительных ячеек................................................31

6.2.    Приготовление измерительных ячеек для непрямого метода........................32

3

УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Председателя Госкомсанэпинадзора России - Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации

__С. В. Семенов

“29” октября 1996 г.

Дата введения - с момента утверждения

Проведение санитарно-бактериологического анализа продовольственного сырья, пищевых продуктов, воды и смывов с поверхностей с использованием бактериологического экспресс-анализатора

Методические указания МУК 4.2.581-96

1. Область применения

Методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора и других организаций, осуществляющих контроль за качеством сырья, продуктов питания, воды и смывов с поверхностей и имеющих в своем распоряжении бактериологический экспресс-анализатор “РЭБИТ”

Издание официальное

4

2. Общие положения

Для успешного выполнения задач, стоящих перед службой санитарно-эпидемиологического надзора в рамках обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия, и экспрессного проведения бактериологических исследований пищевых продуктов, воды, фармпрепаратов, косметических изделий и других объектов окружающей среды необходимы современные автоматизированные экспресс-системы бактериологического анализа, позволяющие повысить качество, экспрессность и достоверность лабораторных исследований, разработать и внедрить новые методы микробиологического анализа.

Классический метод микробиологического анализа является длительным и трудоемким, зачастую по результатам метода можно давать лишь ретроспективную оценку микробиологической безопасности исследуемых объектов.

Применение бактериологического экспресс-анализатора “РЭБИТ” - прибора принципиально новой конструкции для полностью автоматизированного обнаружения микробной контаминации и роста различных микроорганизмов -обеспечит гарантию качества и увеличит эффективность проводимых бактериологических исследований. Благодаря непрерывной регистрации изменения электрических параметров среды, меняющихся вследствие метаболизма микроорганизмов, и полностью автоматизированному процессу сбора и обработки данных, степень микробного загрязнения можно определить через несколько часов.

Принцип действия данного прибора основан на регистрации изменения импеданса (сопротивления) питательной среды прямым и непрямым путем. Рост микроорганизмов приводит к изменению концентрации ионов в питательной среде вследствие метаболизма, приводя, тем самым, к изменению сопротивления питательной среды в заданном интервале времени.

В практике отечественной микробиологии на сегодняшний день известны два прибора подобного типа - “БакТрак 4100” и “Бактометр”, основанные также на измерении импеданса в процессе роста микроорганизмов. Отличительной особенностью прибора “РЭ6ИТ" является высокая стабильность поддержания температуры, развитое программное обеспечение в среде Windows™, возможность использования отечественных питательных сред, многоразовые измерительные ячейки.

Прошедший аттестацию и имеющий Сертификат Госстандарта РФ Я? 1056 от 5 июля 1996 г„ прибор “РЭБИТ” может быть использован как в практических бактериологических лабораториях центров Госсанэпиднадзора, так и в производственных лабораториях предприятий, выпускающих пищевую, молочную, косметическую. фармацевтическую и другую продукцию.

5

Настоящие Методические указания имеют целью способствовать внедрению в практику санитарно-эпидемиологической службы РФ современных, автоматизированных систем для ускоренного определения показателей микробиологической безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, совершенствованию нормативно-технической документации.

Методические указания включают в себя:

•    определяемые с помощью прибора “РЭБИТ* микробиологические показатели по отдельным группам пищевых продуктов, воды, косметических изделий и других объектов:

•    протоколы исследований основных санитарно-значимых показателей (мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - ОМЧ, Грам(-)-бактсрий. псевдомонад, энтеробактерий, колиформных бактерий, в т. ч. Е. coii, сальмонелл, анаэробных бактерий, дрожжей/плесеней, золотистого стафилококка;

•    приготовление питательных сред;

•    методы обработки измерительных ячеек;

•    приготовление измерительных ячеек для непрямого метода.

Нижеприведенные перечни определяемых микроорганизмов в различных продуктах отражают проводимые исследования объектов окружающей среды при использовании бактериологического экспресс-анализатора “РЭБИТ* и, по некоторым продуктам, не содержат всех контролируемых групп микроорганизмов, заложенных в “Медико-биологических требованиях № 5061-89” (например, в ряде продуктов детского питания контролируется количество Вас. cereus в 1 г и в большей массе продукта, чем отсутствие БГКП).

Методы отбора проб, транспортирования, приготовление разведений, используемое оборудование (за исключением специального оборудования, необходимого для работы на анализаторе “РЭБИТ*), посуда и прочее излагаются в соответствующих ГОСТах, методических указаниях, инструкциях.

Порядок установки, запуска и работы на анализаторе “РЭБИТ”, а также необходимые для анализа аксессуары определены в “Инструкции пользователя”, предоставляемой фирмой “SYRUS SYSTEMS Ltd.” при поставке оборудования.

6

8

9