Гла — -    “ санитарный врач

Чекой Федерации Первый    здравоохранения

Чекой Федерации Г.Г. Онищенко

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФЕНМЕДИФАМА В КОРНЕПЛОДАХ Ч ЗЕЛЁНОЙ МАССЕ СТОЛОВОЙ И КОРМОВОЙ СВЁКЛЫ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть. Кргпс' я характеристика препарата

Фирма - производитель: Авентис КропСайенс ГмбХ.

Торговое название препаратов: Бетанал С, Бетанал AM 11, Бетанал 22, Бетанал Прогресс AM, Бетанал Прогресс ОФ, Бетзрен Экспресс AM, Бурефен ФД 11.

Название действующего Еещества по ИСО: Фенмедифам.

Н₃С

Название действующего вещества по ИЮПАК: метил-3-(3-мстилкарбанилокси)-карбанилат; 3 -метоксикарбониламинофснил-3¹ -метилкарбанилат Эмпирическая формула: CicHitNiO*

Молекулярная масса 300,3.

Химически чистый Фенмедифам представляет собой бесцветное кристаллическое вещество с температурой плавления 143-144°С.

Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода К<*, logP= 3,59 (pH 9).

Давление насыщенных паров: 1,33x10* мПа (при 25°С).

Константа Генри (расчетная) 5x10** Па^фмЗ^фмоль'‘. рКа менее 0,1.

Растворимость в воде 4,7 .‘.tr/л (при комнатной температуре).

И

Растворимость (при 20 ⁰ С в г/кг): в ацетоне 200; циклогексаноне 200; этилацетате 56,3; метаноле 50; хлороформе 20; дихлорметане 16,7; толуоле 0,97; гексане 0.5.

Стабилен при температуре ниже 200°С. Очень стабилен в кислых растворах, но гидролизуется в нейтральных и щелочных растворах; DTjo (при 22°С) 50 суток (pH 5), 14,5 часов (pH 7), 10 минут (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика: Фен меди фам относится к малоопасным веществам по острой пероральной токсичности (ЛД50 для крыс и мышей - более 8000 мг/кг, свиней и собак - более 4000 мг/кг) и умеренно опасным веществам по острой дермальной (ЛДи для кроликов 1000 мг/кг) и ингаляционной токсичности (ЛКso (4 часа) для крыс 7000 мг/м³ воздуха). Не раздражает кожу.

Фенмсдифам метаболизируется в почве и растениях, в частности, в свекле. Продуктами метаболизма являются метил-Ы-(3-гидроксифенил)карбамат и м-аминофенол, а также комплексы с компонентами почвы. DTjo в почве - до 25 суток, DT90 - до 108 суток. Фенме-дифам не аккумулируете.'! в почве и не передвигается в растения. Риск проникновения в грунтовые соды отсутствует. В организмах млекопитающих основные пути метаболизма -гидролиз до метил-Ы-(3-^,'ндроксифснил)карбамата и конъюгация до глкжуронидов. 99% Фенмедифама и его метаболитов выводятся из организма с мочой в течение 72 часов.

В России устаговлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,03 мг/кг/сутки; ПДК в почве - 0,25 мг/кг (транслокационный лимитирующий показатель); ПДК в воде водоемов - 0,05 мг/дм³; ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,50 мг/м³; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,001 мг/м''. МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): свекла сахарная, столовая, кормовая - 0,20 мг/кг; цикорий, цикорий салатный - 0,50 мг/кг.

Область применен: я препарата: Фекмедифам используегся в качестве послевсходово-го гербицида в посевах а <арной, столовой и кормовой свеклы. Подавляет развитие широколистных сорняков, дейсп уя через листья. Двудольные сорняки чувствительны к Фенмеди-фаму от фазы всходов до образования четырех настоящих листьев, злаковые - в фазе появления первого листа.

Зарегистрирован в России под торговыми названиями: (в смеси с Десмедифамом): «Бетанал AM 11, КЭ (80+80 г/л)», «Бетанал 22, КЭ (160+160 г/л)», «Бурефен ФД 11, КЭ (80+80 г/л)»; (в смеси с Десмедифамом и Этофумезатом): «Бетарен Экспресс AM, КЭ (60+60+60 г/л)». Рекомендуется применение с нормой расходе препарата до 6 л/га, до трех обработок за сезон (по каждой волне сорняков).

2. Методика определения остаточных количеств Фенмедифама в корнеплодах и зелёной массе столовой и кормовой свёклы методом газожидкостной хроматографии

2.1.    Основные положения.

2.1.1.    Принцип метода.

Методика основе ш на выделении Фенмедифама из анализируемых проб методом экстракции органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимигя жидкими фазами, получении химического производного п>чём гидролитического расщег тения Фенмедифама в 3-метиланилин и бромирования последнего. Определение производного Фенмедифама производится методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора. Идентификация вещества проводиться по времени удерж 'вания. Количественное определение осуществляется методом абсолютной калибровки.

2.1.2, Метрологическая х( ■■тктсристика метода.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах I и 2. Число параллельных определений по • аждой концентрации - 4. Общее число определений п=20. Доверительная вероятность РО,'.5<

4-*

Доверителе ный интервал н полнота определение Фенмедифама

Таблица 2. в корнеплодах и зеленой массе столовой (кормовой) свеклы

Анализируемый объект Добавлено Карбофурана мг/кг (мг/л) Обнаружено Карбофурана мг/кг (мг/л) Доверитель в ый интервал, + Полнота определения, % 1 2 3 4 5 корнеплоды столовой (кор-мовой) свеклы 0,05 0,0419 0,0020 83,0 0.10 0,0832 0,0052 83,2 0.20 0,165 0,0085 82,5 0,50 0,423 0,0107 84,6 зеленая масса столовой (кор-мовой) свеклы 0.05 0,040 0,0034 80,1 0 10 0,081 0,0023 81,0 0.20 0,165 0,0053 82,5 0.50 0,412 0,0176 82,4

2.1.3. Избирательность ме "ода.

В предлагаемых у ловиях метод специфичен в присутствии пестицидов близких по химическому строению (.' обама гы), а также и других примечаемых при возделывании сто-ловой и кормовой свеклы.

2.2. Реактивы, растворы, о горудование и приборы.

2.2.1. Реактивы, растворы а материалы.

Ацетон х.ч., ТУ 6-09-3513 46.

Ацетонитрил х.ч., ТУ 6-0£-3534-74 или для ВЭЖХ «В-230НМ». н-Гексан х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Вода дистиллированная, Г ОСТ 7602-72.

Калия бромат, х.ч., ГОСТ 4457-74.

Калия бромат, 1% раствор, в дистиллированной воде.

Калия бромид, х.ч., ГОСТ<4160-74.

Калия бромид, 20% раствор в дистиллированной воде.

Калия гидроксид (кали едкое), гранулированный, ч.д.а., ОСТ 6-01-301-74.

Кислота серная, концентрированная, х.ч., ГОСТ 14262-78 Кислота серная, 1 н раствор в дистиллированной воде.

Кислота хлороводородная (соляная), концентрированная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Кислота хлороводородная, 0,05 н раствор в дистиллированной воде.

Натрия гидрохсид (натр едкий), х.ч., ГОСТ 4328-77

Натрия гидроксид, 10 н и I н растворы в дистиллированной воде.

Натрия сульфат (натрий сернокислый) безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия сульфит (натрий с ерноватистокислый), ч.д.а., ГОСТ 27068-86.

Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77.

Толуол, х.ч., ГОСТ 5789-73.

Фенмедифам, аналитический стандарт с содержанием д.в. не менее 99,8%, фирма Авентис КропСайенс ГмбХ.

Фильтры бумажные, ТУ 6-С9-1678-77.

Этил ацетат (этиловый эфг р уксусной кислоты), ГОСТ 223000-76.

Этиленгликоль, ГОСТ 10V64-75.

Эфир диэтиловый медищ:чский, ГОСТ 6265-74

2.2.2. Приборы, оборудов-ние и посуда.

Хроматограф “Кристалл 2'Ю0М” с электронозахватным детектором.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая SE-30,25 м (ООО «Предприятие Хим-ресурс XXI», 109429, Россия, г. Москва, ул. Верхние Поля, 24, тел. 359-17-56).

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Баня песчаная.

Ванна ультразвуковая «Серьга» ТУ 3.836.008 или аналогичная.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80 Е или аналогичные.

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой пог^шности + 0,038 г, ГОСТ 19491-74.

Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 25336-82 Е.

Воронки конические, стеклянные диаметром 50-60 мм, ГОСТ 25336-082Е.

Встряхиватель механический, ТУ 64-673М или аналогичный.

Испаритель ротационный вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-76 или аналогичный.

Колбы круглодонные со шлифами, ГОСТ 9737-70.

Колбы мерные на 100 мл, 50 мл и 25мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы плоскодонные конические со шлифами, ГОСТ 9737-70.

Концентраторы грушевидные и круглодонные, объемом 50, 100 и 250 мл, КТУ-100-14/19, ГОСТ 10394-75.

Микрошприц для газожидкостного хроматографа на 5-10 мкл.

Насос вакуумный водоструйный, ГОСТ 25336-82 Е.

Палочки стеклянные, ГОСТ 25336-82Е.

Пипетки на 1,2,5 и 10 мл, ГОСТ 22292-74.

SO

Стаканы стеклянные на 100-500 мл, ГОСТ 25366-80Е.

Цилиндры мерные на 25, 50, 100 и 500 мл, ГОСТ 1770-74 Е.

2.3.    Отбор проб.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы столовой и кормовой свёклы анализируются в день отбора или могут храниться в холодильнике при +4°С в течение 3 дней. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18°С. Непосредственно перед определением пробы корнеплодов столовой и кормовой свёклы и капусты измельчают на тёрке. Пробы зелёной массы измельчают ножницами.

2.4.    Подготовка к определению.

2.4.1.    Приготовление щелочного этиленгликоля.

Растворяют 1 г гранулированного гидроксида калия в 1 мл дистиллированной воды и доводят объём до 25 мл этиленгликолем.

2.4.2.    Приготовление стандартных и градуировочных растворов.

2.4.2.1.    Приготовление стандартных растворов Фенмедифама в ацетоне.

Взвешивают 50 мг Фенмедифама в мерной колбе на 50 мл, интенсивно встряхивая, растворяют навеску в ацетоне и доводят объём до метки ацетоном. (Стандартный раствор №1 с концентрацией Фенмедифама 1,0 мг/мл). Стандартный раствор Х« 1 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев в плотно закрытой посуде.

Переносят 1 мл стандартного раствора №1 в мерную колбу на 100 мл и ацетоном доводят до метки. (Стандартный раствор Xs2 с концентрацией Фенмедифама 10 мхг/мл). Аналогично, методом последовательных разбавлений, готовят стандартные растворы Фенмедифама в ацетоне с концентрациями: 4,0; 2,0; и 1,0 мкг/мл. Стандартные растворы с концентрациями 0,25 - 10,0 мкг/мл устойчивы на холоде в тёмной посуде не более 2 недель.

Стандартные растворы Фенмедифама в ацетоне используют для получения градуировочных растворов и для внесения в корнеплоды и зелёную массу столовой и кормовой свёклы при отработке и апробации методики.

2.4.2.2.    Приготовление градуировочных растворов.

В концентратор добавить 1 мл стандартного раствора Фенмедифама в ацетоне с концентрацией 1,00 мкг/мл. Содержимое концентратора упарить досуха на ротационном ваку-

я

умном испарителе при температуре не выше 30°С. Последовательно перенести тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира содержимое концентратора в термостойкую колбу с плотно пришлифованной пробкой. Током теплого воздуха высушить содержимое колбы. Подвергнуть Фенмедифам щелочному гидролизу. Для этого добавить в колбу 1 мл этиленгликоля и 1 мл щелочного этиленгликоля. Колбу плотно закрыть крышкой и поместить ее в песчаную баню с температурой 180°С на 15 минут. По прошествии этого времени колбу охладить до комнатной температуры. Подвергнуть образовавшийся после гидролиза 3-метиланилин бромированию, при этом все работы следует выполнять в вытяжном шкафу. В колбу добавить 10 мл 1 н серной кислоты, 1 мл бромида калия и 1 мл бромата калия. Содержимое колбы тщательно перемещать и поместить её в темное место на 15 минут. После бромирова-ния избыток брома удал."ют сухим сульфитом натрия. Сульфит натрия добавляют небольшими порциями перемешивая колбу до полного исчезновения жёлтой окраски. В колбу добавляют 1,5 мл 10 н раствора гидроксида натрия. Аккуратно перемешивают содержимое колбы. Экстрагируют бронированный продукт 4 мл толуола. Получают градуировочный раствор с концентрацией 0,25 йкг/мл, в пересчёте на Фенмедифам.

Аналогичным об;»азом готовят градуировочные растьоры с концентрациями 0,50, 1,00 и 2,50 мкг/мл (в пересчёте на Фенмедифам). Для этого берут по 1 мл стандартных растворов с концентрациями 2,0,4,0 и 10,0 мкг/мл, соответственно.

Градуировочные растворы используют для построения калибровочного графика.

2.4.3.    Подготовка и кондн/'юниро ванне колонки для газожидкостной хроматографии.

Капиллярную квар левую колонку SE-30,25 м устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют прв температуре 180°С, давлении газа носителя (Газ 1) 80 кПа, расходе газа носителя (Газ 2) 3,5 мл/мин, сбросе 1:20 и поддуве (Газ 3) 30 мл/мин в течение 6 часов.

2.4.4.    Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика (площадь пика - концентрация градуировочного рас гвора в Перес сте на Фенмедифам) вводят в хроматограф по 1 мкл градуировочных растворов. Измеряют площадь пиков (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации). Строят гг >фнки зависимости площади хроматографического пика от расчётной концентрации Фенме чфама.

я.

2.5. Описание определения.

2.5.1. Ботва и корнеплоды столовой и кормовой свеклы.

Измельченный образец корнеплодов или зеленой массы столовой (кормовой) свеклы, массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл. В колбу вносят 5-10 мл 0,05 н раствора соляной кислоты. Прибавляют 40 мл смеси ацетонитрил - 0,05 н соляная кислота в соотношении 9:1 и помещают колбу на 5 минут в на ультразвуковую ванну, затем экстрагируют Фенмедифам в течение 20 минут на качалке. Процедуру экстракции повторяют еще 2 раза, используя по 30 мл ацетонитрила. Экстракты фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» в делительную воронку на 250 мл.

В делительную всронку добавляют приблизительно 3 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают в течение ЗС секунд. После разделения слоев нижний водный слой с остатками не растворившегося хлор: да натрия отбрасывают.

К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному слою прибавляют 40 мл гексана и интенсивно вс ряхивают в течение 1 минуты. После полного разделения слоев нижний ацетонитрильньг слой собирают в химический стакан объемом 200 мл. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт из химического стакана снова переносят в делительную ооронку. Повторяют процедуру промывки ацетонитрильного экстракта гексаном еще 2 р.па, используя по 30 мл гексана. После завершающей промывки нижний ацетоннтрильны! слой собирают в концентратор на 100 мл, пропуская его через слой безводного сульфате натрия.

Ацето нитрильны . экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не вы к 30°С.

В концентратор убавляют 2 мл ацетона, тщательно растворяют сухой остаток. Для лучшего растворения кон ’/итератор помещают на ¹Л минуты в ультразвуковую ванну. Содержимое концентратора акгуратно переносят в делительную воронку. В концентратор повторно добавляют 2 мл ацетсиа, тщательно обмывают стенки. Содержимое переносят в ту же делительную воронку. К объединенным порциям ацетона добавляют 100 мл 1 н раствора гидроксида натрия (pH 9) и дистиллированной воде. Плавно встряхивают в течение 1 минуты.

В делительную воронку добавляют 40 мл этилацетата. Интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. Оставляют делительную воронку в покос. Поте полного разделения сло€в нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл. Верхний слой собирают в концентратор на 25С мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Содер-

S3

жимое химического стакана снова переносят в делительную воронку. Повторяют процедуру экстракции Фенмедифамп ещё 2 раза, используя по 30 мл этилацетата. Все слои этилацетата объединяют в концентра горе на 100 мл. Процедуру экстракции следует проводить по возможности быстро.

Этилацетат упаригают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С досуха Остатки растворителя отдувают из концентратора воздухом комнатной температуры не менее 3 минут.

Получение производных фенмедифама.

Содержимое концентратора последовательно перенести тремя порциями по 2 мл ди-этилового эфира в термостойкую колбу с плотно пришлифованной пробкой. Током теплого воздуха высушить содержимое колбы. Подвергнуть Фенмедифим щелочному гидролизу. Для этого добавить в колбу 1 мл этиленгликоля и 1 мл щелочного этиленгликоля. Колбу плотно закрыть крышкой и помг ггить её в песчаную баню с темпера гурой 180°С на 15 минут. По прошествии этого времен i колбу охладить до комнатной температуры. Подвергнуть образовавшийся после гидролиза 3-метил анилин бромированию, при этом все работы следует выполнять в вытяжном пкафу. В колбу добавить 10 мл 1 н серной кислоты, 1 мл бромида калия и 1 мл бромата казня. Содержимое колбы тщательно перемешать и поместить её в темное место на 15 ми цуг. После бромирования избыток брома удаляют сухим сульфитом натрия. Сульфит натрия обавляют небольшими порциями перемешивая колбу до полного исчезновения жёлтой окр оки. В колбу добавляют 1,5 мл Юн раствора гидроксида натрия. Аккуратно перемешиваю содержимое колбы. Экстрагируют бронированный продукт 4 мл толуола. Из слоя толуолг микрошприцом отбирают аликвоту 1 мкл и вводят её в хроматограф.

2.6. Условия хроматограф ювания и обработка результатов.

2.6.1. Условия хромалогр фирования.

Хроматограф “Кристалл '000М” с электронозахватным детехтором или другой с аналогичными характеристиками.

Капиллярная кварцевая к<. донка SE-30, длина 25 м.

Температура детектора - _’.40⁰С, испарителя - 210°С, программированный нагрев колонки - с 180°С (const 3 мин) до 2К.°С по 10 градУмин, 210°С const 6 мин.

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, давление 80 кПа.

Газ 2 (азот) - 10 мл/мин: расход 0,5 мл/мин, сброс 1:20.

Режим Splitless, начало сб юса 5 сек, длительность сброса 30 сек,

яг

минимальный расход 20 мл/мин.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 30 мл/мин.

2.6.2.2. Обработка результатов анализа.

Содержание Фенмедифама рассчитывают по формуле:

Snp • А•V

Х=--х    Р

100 • Sct • m

где X - содержание Фенмедифама в пробе, мг/кг,

Sct - площадь (высота) пика стандарта, мВ*с;

Snp - площадь (высота) пика образца, мВ*с;

А - концентрация i радуйровочного раствора в пересчете на Фенмсдифам, мкг/мл;

V - объем экстракт- , подготовленного для хроматографирования, мл; ш - масса анализируемого образца, г,

Р - содержание Фегнеднфама в аналитическом стандарте, %.

3.    Требования техники безопасности.

Необходимо соблгадать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, элекгронагре1»ательными приборами и сжатыми газами. При авали» образуется свободный бром, который является чрезвычайно опасным веществом, потому все работы, связанные с дериватизацией пробы необходимо проводить в выти: .чом шкафу. Персонал лабораторнв должен быть обучен правилам безопасности.

4.    Разработчики.

Калинин В.А., пр-Ьессор, канд. с-х. наук, Быков К.В., гауч. сотр.

Московская сел) скохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева. Учебнонаучный консультационнг П центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».

Адрес: 127550, М* сква, ул. Тимирязевская, д. 53/1. Телефон: (095)-976-37-68; факс: (095)-976-43-26

/г