«УТВЕРЖДАЮ»

Главный санитарный врач РФ, Первый Зам. Министра Здраво/ хранения РФ / 1Л^р*^,уТ1.Г. Онищенко « А »    I    /    \    2004    г.

^МУКХrttZTT&ZZ........

Дата введения: с /Ь»к ?

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОПИРАЛИДА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Вводная часть.

1.1. Краткая характеристика препарата.

Фирма-изготовитель: Дау АгроСаенссс.

Торговое название: Лонтрел Гранд, Лонтрел-300.

Действующее вещество (д.в.): клопиралид.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: 3,6-*(11сЫогорупФпе-2-сагЬохуНс acid. Структурная формула д.в.:

Эмпирическая формула д.в.: C^HjCfeNO?. Молекулярная масса д.в.: 192,0.

Химически чистое вещество: кристаллы белого цвета. Температура плавления д.в.: 151-152°С.

//О

Растворимость д.в. (r/кг) при 20°С: в воде - 1,0 , циклогексаноне - 387, ацетоне * 153, ксилоле - 6,5.

В обычных условиях устойчив, с органическими и неорганическими основаниями образует хорошо растворимые в воде соли.

1.2.    Краткая токсикологическая характеристика д.в.

LD50 для крыс - 4300*5000 мг/кг, LCso (96 ч) для рыб - 103,5 мг/л. Нетоксичен для пчел и других насекомых.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,04 мг/л, ОДК в почве - 0,1 мг/кг, МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, ВМДУ в кукурузе и сахарной свекле -0,1 мг/кг, капусте - 0,05 мг/кг.

1.3.    Область применения препарата.

Гербицид для борьбы с некоторыми однолетними и многолетними двудольными сорными растениями (в том числе сложноцветными и видами горца).

2. Метод определения клопиралида в семенах и масле рапса с применением капиллярной газожидкостной хроматографии.

2.1.    Основные положения.

2.1.1.    Принцип метода.

Метод основан на извлечении остаточных количеств клопиралида из анализируемого объекта органическими растворителями и проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Количественное определение проводя! методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ).

2.1.2.    Избирательность метода.

Метод специфичен в присутствии других применяемых пестицидов. Проведение очистки экстрактов, а также использование капиллярной колонки и селективного детек-юра позволяет устранять влияние коэкстракгивных веществ на результаты анализа.

2.1.3.    Метрологическая характеристика метода.

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метроло-I и чес кие параметры метода представлены в таблицах 1 и 2.

///

Таблица 1. Метрологические параметры метода.

Метрологические параметры Анализируемые объекты: Семена рапса Масло рапса Предел обнаружения, мг/кг 0,01 0,02 Диапазон определяемых концентраций, мг/кг 0,01-0,08 0,02-0,16 Среднее значение определения, % 80,2 77,8 Стандартное отклонение, % 5,5 6,2 Относительное стандартное отклонение, % 3,1 3.5

Таблица 2. Полнота определения клопиралида в модельных пробах (п=6).

Анализируемые объекты Внесено, мг/кг Извлечено, % Доверительный интервал среднего результата, % 0,01 73,5 ±7.6 Семена рапса 0,02 78,1 ±5,5 0,04 83,7 ±4,8 0,08 85,4 ±4,3 0,02 74,3 ±7,1 Масло рапса 0,04 76,5 ±6,7 0,08 78,8 ±5,8 0,16 81,7 ±5,2

2.2. Реактивы, растворы, материалы.

Аналитический стандарт клопиралида.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, хч, ТУ 6-09-4326-76.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

Вода дистиллированная и перегнанная над КМпС>4 и щелочью. н-Гексан, хч, ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, хч, ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, чда, ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), чда, ГОСТ 4166-76.

Наггрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77. /У-Нитроэометилмочсвина, хч, ТУ 6-09-11-1643-82.

//£

Серная кислота, осч, ГОСТ 14262-78.

Смесь н-гсксан:этиловый эфир, 50:50, по объему.

Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Эфир этиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда.

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (типа OV-17), толщина пленки 0,5 мкм. Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р.51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная. Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1,2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100,200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл, ТУ 64-2-10-87. Шкаф сушильный, ТУ 64-1 -1411 -76.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

//3

2.4.    Подготовка к определению.

2.4. ]. Подготовка и очистка растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2.    Приготовление стандартных растворов.

Основной раствор клопирапида с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в ацетоне 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4-6°С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 1,6, 0,8, 0,4 и 0,2 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клопирапида последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре +4-6°С не более месяца.

В модельных опытах при изучении полноты извлечения клопирапида используют ацетоновые растворы стандартного вещества.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов клопирапида с концентрациями 0,2, 0,4, 0,8 и 1,6 мкг/мл. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование клопиралида по п.2.4.3.

2.4.3.    Метилирование клопиралида

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного по п.2.4.5. эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого в пробирки добавляют по 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

2.4.4.    Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа (п:2.7.3.) вводят по 1 мкл приготовленных по п.2.4.3, растворов, содержащих клопиралид (в виде производного) в концентрациях 0,2,0,4,0,8 и 1,6 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (мм²) от концентрации клопиралида в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.5.    Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования экстрактов 2-х проб).

У-Нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0-3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр.диам. - 1,5-2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозомстилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание ! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

2.5.    Отбор, первичная обработка и хранение проб.

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными 2! .08.1979г., № 2051 -79.

Пробы семян рапса просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы масла рапса хранят при +4-6°С в закрытой стеклянной таре.

2.6.    Подготовка проб к определению.

Пробы семян рапса перед анализом рассылают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемеши-нания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

2.7.    Проведение определения.

2.7.1.    Семена рапса.

2.7.1.1.    Экстракция клопиралида.

Аналитическую пробу семян массой 20±0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон дистиллированная вода (90:10), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. По-

еле этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон .-дистиллированая вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон дистиллированная вода (90:10) и встряхивают в течение 60 минут. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон:дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10-20 мл при температуре +40°С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0 % водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4-6°С в течение 4-5 часов. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до pH 9-10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 15-ти минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта с использованием 50 мл дихлорметана повторяют. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан ем-хостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан : этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя - 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан : этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40°С до объема 3-5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре

•40°С.

2.7.1.2.    Метилирование клопиралида.

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п.2.4.5, эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п.2.7.3.

2.7.2.    Масло рапса.

2.7.2.1. Экстракция клопиралида.

Аналитическую пробу масла массой 10,0±0,1 г растворяют в 50 мл н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл н после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 100 мл. Колбу промывают еще 25 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и также переносят в воронку (250 мл). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают 5 минут и нижний ацетонитрильный слой объединяют с предыдущим. Верхний 1сксановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при темпера rype +50°С. Сухой остаток растворяют в 20 мл ацетона. К раствору добавляют 200 мл Аидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0% водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4-6°С в течение 4-5 часов. После этого содержимое полбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емко-Отмо 500 мл. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до pH 9-10,

К) мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дичлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После

//?

15-ти минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта с использованием 50 мл днхлорметана повторяют. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-ти минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан : этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0-1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан : этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40°С до объема 3-5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре +40°С.

2.72.2. Метилирование клопиралида.

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п.2.4.5, эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12-14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4-6°С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п.2.7.3.

2.7.3. Условия хроматографирования.

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (типа OV-17), толщина слоя 0,5 мкм.

Температура колонки: программирование от 100°С (3 мин) до 280°С (25 мин) со скоростью 8,0°СЛмин.

Температура испарителя: 240°С.

Температура детектора: 300°С.

Расход газов: газа-носителя (азот в/ч) - 1,5 см³/мин, дополнительного газа (азот u/ч) к ДЭЗ - 40 cwVmhh.

Объем вводимой пробы: 1 мкл.

Время удерживания клопиралида (в виде производного): 14,18±0,05мин.

Предел детектирования: 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,2-2,0 нг.

2.7.4. Обработка результатов анализа.

Содержание клопиралида рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле: H,xAxV

X- -.где:

Нохш

X - содержание клопиралида в пробе, мг/кг,

Н| - высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мм²),

Но - высота (площадь) пика стандартного вещества, мм (мм²),

А - концентрация стандартного раствора клопиралида, мкг/мл,

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл, ш - масса (г) аналитической пробы.

3.    Требования техники безопасности.

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами, а также требования, изложенные в документации к приборам.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

5.    Разработчики.

П.А.Тарарин, Т.А. Маханькова, Л.В. Григорьева (ВНИИ защиты растений).

/S3