«УТВИ

Главный Государственший сашДгарный врач РФ Первый зам. Миш*(п^^^у;и1(1)хранения РФ ________I    Г.Г.Онишенко

2004 г.

мук 4.1.

Дата введения:    iАч.4 iMbi

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАРБОКСИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

1. Вводная часть

Фирма производитель: Алсико Агропром. Торговое наименование: Витасил. Действующее вещество: карбоксил. Структурная формула:

5.6- Дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-З-карбоксанилид (IUPAC).

5.6- Дигидро-2-метил-//-фенил-1,4-оксатиин-3-карбоксамид (С. А.).

Брутто формула: C^HuNOiS.

Мол. масса: 235,3.

Белые кристаллы (технический - белый порошок).

Температура плавления: 91,5-92,5°С и 98—100°С (в зависимости от типа кристаллов). Давление паров при 25®С: 2.5><10*²мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log Р ■ 2,2 (25°С).

30

Рм торимостъ (мг/л) при 25°С: ацетон - 177, дихлорметан - 353, метанол - 88, зтилацетат -

•    иода - 199 мг/л (при pH 7 и 25°С).

РМцвство устойчиво к гидролизу (25°С, pH 5-9), быстро разлагается в водных растворах при ■магрживании на свету (pH 9, DTso <3ч).

!• |чикан токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность (LDjo) для крыс IM20 мг/кг; острая дермальная токсичность (LDjo) для кроликов - более 4000 мг/кг. Чуинснный эффект при использовании препарата не наблюдался. Класс токсичности по

ибз-ш.

I hi исничсские нормативы для карбоксина в России: ОДК в почве - 0,05 мг/кг; ПДК в воде рндоомов - 0,02 мг/л; МДУ для зерна хлебных злаков, проса, кукурузы - не допускается.

•    класть применения препарата: Карбоксин - фунгицид системного действия. Используется м м обработки семян пшеницы, овса и ячменя против головневых болезней, корневых гнилей •• нлсснсвения семян зерновых культур. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.

2. Методика определения карбоксина в воде, почве, зерне н соломе зерновых колосовых культур методом ВЭЖХ

2.1.    Основные положения

2.1.1.    Принцип метода

Методика основана на определении карбоксина методом ВЭЖХ с использованием V'P детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем распределения между двумя жидкими нссмешивающимися фазами, а также на м.мистрирующих патронах Диапак С-16.

2.1.2.    Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Метрологическая характеристика метода

(>бьскт шшлиза Предел обнаружс ния мг/кг Диапазон определяемых концентраций мг/кг Среднее значение определения, % (для каждого объекта п*24) Относительное стандартное отклонение S, % Доверительны Й интервал среднего, п*24, Р=0.95 Пода 0.002 0.002-0.02 91,4 5,60 4,91 Почва 0.01 0.01-0.1 82,5 7,18 6,29 Зерно пшеницы 0.01 0.01 -0.1 83,2 8,04 7,05 ( нлома пшеницы 0.02 0.02 - 0.2 80,1 8,60 7,54

Полнота определения карбокснна в воле, почве, зерне и соломе зерновых колосовых (n*N+l=6 для каждой концентрации)

Таблица 2

Среда Внесено, мг/кг Найдено, мг/кг Стандартное отклонение, S± Полнота определения, % 1 2 3 4 6 Вода 0,002 0,00185 UNO*” 92,7 0,004 0,00361 2,78-10“* 90,2 0,01 0,00911 5,25-1 O'* 91,1 0,02 0,0183 1,H-10*J 91,5 Среднее 91,4 Почва 0,01 0,00823 8,17*10“* 82,3 0,02 0,01628 1,4110J 81,4 0,05 0,04175 3,19-103 83,5 0,1 0,0827 7,13-10'* 82,7 Среднее 82,5 Зерно | пшеницы 0,01 0,00827 8,27-1 O'* 82,7 0,02 0,01666 1,63-10" 83,3 0,05 0,04205 4,21-10" 84,1 0,1 0,0827 7,33-10" 82,7 Среднее 83,2 Солома пшепицы 0,02 0,01578 1.81-КГ3 78,9 0,04 0,03164 3,53-10J 79,1 0,1 0,0805 7,99-10" 80,5 0,2 0,1634 1,71-10^ 81,7 Среднее 80,1

2.1 J. Избирательность метода.

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению нс мешает.

2.2. Реактивы и материалы.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Бумажные фильтры "синяя лента", 'ГУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Карбоксин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,7%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76. свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, хч., ГОСТ 4328-77.

32

И I мм им, х.м.,ТУ 2631-003-05807999-98, свсжспсрегнанный.

ii tHiiMimx фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (45:55, по объему).

I I»» ПОПП III.

I    нснтоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

I |t*i|nniM Диамак С-16

• ........ дли патронов Диапак С-16: вода - ацетон (70:30, по объему).

2.J. Приборы и посуда.

Фи’Нммтный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487),

•    и ■ *i мный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или

........нчнмй.

♦>••.....пи Symmetry-С18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

и, • аиолонка Waters Symmetry С-18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

И»»’М аиилитическис ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

И.. .••. фуйный насос, ГОСТ 10696-75.

..........пи Ьюхнсра, ГОСТ 0147-73.

>. шпонки ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

' и и,пицц ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, 'ГУ 1-01-0593-79.

Г»1Я1|ШШИЫЙ испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

lilHIII 1ИЛЛЯГ0р.

и.. ... полосгруйный, МРТУ 42 861-64.

|»м.»Пи 1.унзсна, ГОСТ 5614-75.

г мпПм плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

•    ■ юм круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

и ........ лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

и- | ики делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Мнлнилры мерные на 100, 250 и 1000 см³, ГОСТ 1774-74.

•    и м мерные на 25, 50, 100 и 1000 см³, ГОСТ 1770-74.

I Ii.ii. Iкм ни 1,2,5, 10 см³, ГОСТ 22292-74.

» ....инонный испаритель, ТУ 25-11-917-76.

2.4.    Отбор проб.

(>|бор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора . »• лi.cнехозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды . • • определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных •<-икр и ял о в хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С. Для (ИН14ЛЫ10ГО хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в .мм тис свега. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом »• >м» почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы зерна измельчают

*    сПора торной, а соломы - на ножевой мельнице. Пробы воды хранят в бутылях темного •■••'ill и холодильнике при температуре 1-4°С в течение 3 суток, при температуре -18°С (в

•    •«• 1ИКОВЫХ бутылях) - в течение месяца.

2.5.    Подготовка к определению.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей.

< >pi иноческие растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в • и.mi l мии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями

33

концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г КМпОч и 2 г K₂COj).

Ацетонитрил (марки х.ч.) сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (I мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.

2.53. Приготовление растворов.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 450 мл ацетонитрила с 550 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента для патронов Диапак С-16 (далее - элюент) в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл дистиллированной воды и 300 мл ацетона. Для приготовления 20% раствора хлористого натрия 200г кристаллического NaC! помещают в мерную колбу на 1л, растворяют при перемешивании в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

2.5.4.    Приготовление стандартного н градуировочных растворов:

Берут точную навеску карбоксина (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1.0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1. 0.2, 0.5, 1.0 и 2.0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил:бидистиллированная вода = 45:55, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение I месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При определении полноты извлечения карбоксина из пробы для внесения в контрольные образцы используют градуировочные растворы.

Внимание! Карбоксин быстро разлагается в водных растворах на свету (см. п.1), поэтому следует избегать попадания прямого света на пробы и стандартные растворы хранить во флаконах темного стекла.

2.5.5.    Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6.    Подготовка патрона Диапак С-16 для очистки экстракта.

Концентрирующий патрон Дипак С-16 промывают последовательно с помощью шприца 20 мл ацетона и 20 мл воды со скоростью 5мл/мин. После чего он готов к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения карбокснна на патроне Диапак С-16

И ируглодонную колбу емкостью 100 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора

. мнп с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, ««нш растворяют в 50 мл воды и наносят на приготовленный по п.2.5.6, патрон. Колбу Ж1МИП еще 10 мл воды и также наносят на патрон. Элюат отбрасывают. Как только ,_г инн. жидкости достигнет верхнего края патрона, его промывают 70 мл элюента. (Нельзя .. •him. высыхания твердой фазы в патроне). Отбирают фракции по 10 мл каждая, .ыриникгг, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭИОС (п. 2.5.3.) и анализируют .. . -и ржание карбоксина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие карбоксин, объединяют, выпаривают досуха, остаток мм iMipmoT в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. I.... омывают содержание карбоксина в элюатс, определяя полноту вымывания вещества из ..*1рмнп и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания карбоксина может меняться при использовании ......It imp I ин патронов Диапак С-16.

2.5. Н. Подготовка приборов и средств измерения.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в . ...мисмспжн с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.    Проведение определения.

2.6.1.    Определение карбоксина в воде.

обризец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл переносят в . ннюльную воронку емкостью 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 50 мл, .. фчямпля каждый раз в течение 2-3 минут и отбрасывая после расслаивания верхний I••4НИЧССКИЙ слой. Затем добавляют к воде 100 мл 20%-ного раствора NaCl и экстрагируют

. ...... 1сксаном    трижды    порциями    по 50 мл. встряхивая каждый раз в течение 2-3

мим. I ОбьединенныЙ экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), . мммель промывают 10-15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на 1«мми1мон11ом испарителе при температуре не выше 40°С.

( ухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкп раствора .....hi и жидкостный хроматограф.

2.6.2.    Экстракция карбоксина из проб почвы, зерна и соломы пшеницы.

()бразец воздушно-сухой почвы, измельченной на ножевой мельнице соломы, массой Ю I или предварительно размолотого на зерновой мельнице зерна, массой 20 г, помещают в . шип кую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-го водного «нм мня и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на • и I- Iхиной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют ' " • • лнненные экстракты упаривают до водного остатка (45-50 мл) на роторном испарителе "1'М и миературе не выше 40°С, фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр миля лента". Объбм раствора доводят до 50 мл, дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.3.

2.6.3.    Очистка экстрактов на патроне Диапак С-16

Полученный по п. 2.6.2. раствор количественно переносят в подготовленный по п. I >6 патрон Диапак С-16. Колбу обмывают ещб 10 мл дистиллированной воды и также

дг

переносят на патрон.* Элюат отбрасывают. Карбоксин элюируют 50 мл элюента. Ацетон упаривают до водного остатка (35-40 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.4.

2.6.4.    Очистка экстрактов.

Объем водного остатка доводят до 50 мл, переносят в делительную воронку объемом 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 10 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 минут и отбрасывая после расслаивания верхний гексановый слой. Затем добавляют 100 мл 20% раствора NaCI и карбоксин экстрагируют гексаном трижды по 50 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2-3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40°С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5.    Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы «Waters» с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry-С18 (250x4.6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 25±1°С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20x3.9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для зашиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 45:55 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 250 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания карбоксина 9.8 ± 0.2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0.1 -2.00 мкг/мл.

2.6.6.    Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание карбоксина в образце воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

SjxCxV

X--

S,xP

где Sj- площадь пика карбоксина в стандартном растворе, сд.адс.хс;

Sj- площадь пика карбоксина в анализируемой пробе, ед.адс.хс;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);

С -- концентрация стандартного раствора карбоксина, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств карбоксина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина 2 мкг/мл разбавляют.

3.    Требования техники безопасности.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные нрои/iu безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила Ааинюсиости при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также мж'фукции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4.    Контроль погрешности измерений.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений рцушоствляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль мчмнпи результатов количественного химического анализа.

5.    Разработчики

ПнОу/аская И.А., Долженко В.И., Юзихин О.С., Черменская ТД.

(Мироосийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург).

3?