ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

(Сборник нормативных материалов)

Москва, 1994 г.

Брагина И. В., Орехова II. Л- — специалисты лаборатории физико-химических методов исследований Российского Республиканского информационно-аналитического центра.

Под редакцией: Подуповой JI. Г. — заместители Главного государственного санитарного врача РФ, заслуженного врача РФ.

Подписано к печати. 21.11.94.

Формат 60 х 88/16. Бумага офсетная. Уел. псч. л. 9,8. Уел. кр.-огг. 9,8. Тираж 1000 экз. Зак. 220.

Изготовлено в Московской типографии № 11 Комитета по печати РФ. 113105, Москва, ул. Нагатинская, 1,

ВВЕДЕНИЕ

Загрязнение пищевых продуктов токсичными чужеродными веществами является частью глобальной проблемы загрязнения окружающей среды, поэтому в настоящее время очень важным аспектом является определение микропримесей загрязняющих веществ в продуктах питания и снижение их содержания. В последние годы все больший приоритет приобретают исследования по определению таких токсикантов как различные микотоксины (афла-токсины, патулин, зеараленон, вомитоксин, трихотецены и др.), соли тяжелых металлов, нитриты, нитраты, N-нитрозамины и др.

Настоящий сборник включает в себя ранее изданные Методические указания по определению наиболее приоритетных загрязнителей пищевых продуктов, разработанные научно-исследовательскими институтами медицинского профиля и утвержденные Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Минздрава СССР и ГКСЭН РФ.

В соответствии с Постановлением Госкомсанэп ид надзора Российской Федерации от 06.02.92 г. № 1 *0 порядке действия на территории Российской Федерации нормативных актов бывшего Союза ССР в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» на всей территории Российской Федерации действуют общесоюзные санитарные правила и нормативные акты впредь до принятия соответствующих нормативных актов Российской Федерации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Сборник предназначен для санитарно-гигиенических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, НИИ и учреждений гигиенического профиля, кафедр гигиены питания медицинских институтов и институтов усовершенствования врачей, а также может быть использован лабораториями других организаций, занимающихся исследованиями пищевых продуктов.

Будем признательны за все критические замечания и пожелания, направленные на улучшение данного Сборника или составление аналогичных Сборников по другим разделам исследований пищевых продуктов.

Л. Г. Подунова

2

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОХРАТОКСИНА А В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ¹

Оборудование и материалы

1.    Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

2.    Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлабприбор»),

3.    Кофемолка ЭКМ-ЗУ.

4.    Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

5.    Жидкостный хроматограф высокой эффективности «Аптеке¹ модель 336 или дргой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, типа «Ultrasphere-ODS¹, с размером частиц 5 микрон; длина колонки 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр колонок—0,46 см; флуоресцентный детектор «Кратос¹ модель FS-970 или другой детектор с аналогичными параметрами.

6.    Микрошприц —МШ-10 на 10 мкп.

7.    Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например,стеклянныечетырехугольныесосуды 195 х 195 х 200 мм завода «Дружная горка».

8.    Пластины для ТСХ «Силуфол» размером 15 х 15 см или 20 х 20 см, ЧССР.

9.    Воронки делЬтельные ВД2-250 по ГОСТ 8613-75.

10.    Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

11.    Колбы плоскодонные конические на 250 мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

12.    Колбы круглодонные на 250 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

13.    Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.

14.    Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

15.    Распылитель стеклянный с грушей.

16.    Бензол «чда» по ГОСТ 5955-75.

17.    Гексан «ч» по ТУ 6-09-3375-78.

18.    Метанол «хч» по ГОСТ 6995-77.

19.    Толуол «чда» по ГОСТ 5789-78.

20.    Хлороформ для наркоза или по ГОСТ 3610-51.

21.Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) «чда» по ГОСТ 22300-76.

22.    Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52.

23.    Кислота муравьиная «чда» по ГОСТ 5848-73.

24.    Кислота уксусная «хч* по ГОСТ 61-75.

25.    Кислота серная «чда» по ГОСТ 4204-77.

26.    Натрий сернокислый безводный «чда» по ГОСТ 4166-76.

27.    Натрий углекислый кислый (гидрокарбонат натрия) «чда» по ГОСТ 4201-79.

28.    Натрий углекислый (карбонат натрия) «чда* по ГОСТ 83-79.

29.    Бумага индикаторная универсальная по ТУ 6-09-1181-76.

1. Экстракция

При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12430-66 «Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе». Отобранную пробу измельчают в течение 1—2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 12,5 мл 1% раствора уксусной кислоты в воде и 125 мл хлороформа. Встряхивают на аппарате для, встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 50 мл фильтрата.

5S

2. Очистка экстракта

В делительную воронку переносят 50 мл фильтрата, добавляют 35 мл 3% раствора гидрокарбоната натрия в смеси метанол—вода (2:8). Встряхивают, после разделения слоев верхний водный слой отделяют. Нижний хлороформный слой дважды (2 х 35 мл) экстрагируют водно-метанольным раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные водные экстракты встряхивают в делительной воронке с хлороформом (2 х 25 мл), каждый раз после разделения слоев отбрасывая нижний хлороформный слой. Водный экстракт подкисляют раствором серной кислоты в воде с концентрацией 2 моля/литре до pH 2—3 по универсальной индикаторной бумаге (примерно 9,5—10 мл раствора серной кислоты). Подкисленный водный раствор немедленно экстрагируют в делительной воронке хлороформом (1 х 50 мл и2 х 25мл).Объединенныехлороформные экстракты сушат безводным сернокислым натрием (10—12 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через [имическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл с НШ 29, сернокислый натрий промывают 15 мл хлороформа и отфильтровывают хлороформ в ту же колбу. Хлороформный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40—45° С. Остаток растворяют в 5 мл хлороформа и фильтруют через химическую воронку со складчатым фильтром из плотной фильтровальной бумаги в фушевидную колбу на 50 мл с НШ 14,5. Круглодонную колбу споласкивают 5 мл хлороформный смыв фильтруют в ту же грушевидную колбу на 50 мл, фильтр затем промывают 2 мл хлороформа. Хлороформный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 400 мкл смеси бензол—уксусная кислота (99:1) для проведения ТСХ анализа или в 400 мкл метанола для проведения анализа с помощью ВЭЖХ (раствор А).

3. Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Стандартный раствор охратоксина А готовят следующим образом: навеску 5 мг охратоксина А* растворяют в мерной колбе на 100 мл смесью бензол—уксусная кислота (99:1), концентрация полученного стандартного раствора примерно 50 нг/мкл. Для установления точной концентрации стандартного раствора измеряют его оптическую плотность при длине волны 330 нм (D330). Кон-цен-трацию раствора вычисляют по формуле:

— по поводу приобретения стандарта охратоксина Л обращаться в Институт питания АМН СССР

59

Дззох 1000x403,8    ,

-5500-^НГ/МКЛ

Стандартный раствор хранится в холодильнике при температуре ниже 0°С, срок годности стандартного раствора до 1,5 года.

Рабочий раствор охратоксина А для ТСХ готовится разбавлением стандартного раствора охратоксина в 10 раз смесью бензол—уксусная кислота (99:1) и имеет концентрацию 5 нг/мкл.

Рабочий раствор охратоксина А для ВЭЖХ готовят следующим образом: 100 мкл (0,1 мл) стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 50 нг/мкл разбавляют метанолом до объема 5 мл, получая рабочий раствор для ВЭЖХ с концентрацией 1 нг/мкл.

^Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза — метанол—вода—уксусная кислота (75:25:1,5), скорость потока подвижной фазы — 1 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол и биди-стиллированную воду, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. Флуоресцентный детектор устанавливается на длину волны возбуждающего излучения — 330—333 нм (или устанавливается соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуоресцентным детектором без монохроматора), на линии эмиссии устанавливается эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 415—420 нм. Входное напряжение самописца—10 мВ, чувствительность детектора устанавливается таким образом, чтобы 5 нг охратоксина А соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Предел обнаружения при таких условиях составляет 0,5—1 нг охратоксина А во вколе.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводится 2,5 и 3 мкл рабочего раствора для ВЭЖХ, что соответствует 2, 5 и 3 нг охратоксина А. Для каждого количества введенного охратоксина А определяют высоту пика. При описанных выше условиях ВЭЖХ время выхода пика растворителя составляет 2,2—2,5 мин., а время выхода пика охратоксина А от 6,5 до 8,5 мин. в зависимости от небольших изменений в составе подвижной фазы и времени уравновешивания колонки.

В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора А (раствор очищенного экстракта в 400 мкл метанола). При наличии пика, совпадающего по времени выхода с охратоксином А, определяют его высоту (Ьобр).

Расчет концентрации охратоксина А в образце проводят по формуле:

_л VixV3Xmcr.Xho6p. , _ ^с —^м*^г/^кг' ^r*=^:

Vi — объем хлороформа для экстракции образца в мл (125);

V2 — объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа в мл (50 мл);

Уз — объем экстракта (раствор А) в мкл (400 мкл);

V4 — объем экстракта (раствор А), введенный в хроматограф, в мкл (20 мкл);

ш_Ст. — масса стандарта охратоксина А, введенная в хроматограф, в нг;

Ьст. — высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм; ho6|>.— высота пика охратоксина А из образца, в мм;

М — навеска образца для анализа в г (25 г).

Если пик охратоксина А в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно после разбавления раствора экстракта (раствор А) метанолом (после увеличения объема Уз).

5. Обнаружение и количественное определение охратоксина А с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слой силикагеляоа. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см ог краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А (раствор экстракта в 400 мкл смеси бензол—уксусная кислота (99:1). В правом верхнем и левом нижнем углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят по 3 мкл рабочего раствора охратоксина А для ТСХ (по 15 нг охратоксина А). Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-гексан—хлороформ—муравьиная кислота (30:30:30:1) и развивают пластинку в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут. Затем проводят развитие пластинки во 2-ом направлении в системе толуол—этилацетат—муравьиная кислота (55:35:10). После достижения фронтом тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Пятна охратоксина А флуоресцируют в этих условиях зелено-синим цветом. Пластинку опрыскивают насыщенным раствором карбоната натрия в воде и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Цвет флуоресценции охратоксина А должен измениться на синий. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цветам флуоресценции и хроматографической подвижности в двух системах пятнам стандарта охратоксина А, свидетельствует о наличии охратоксина А в образце.

Для количественного определения охратоксина А пластинку ♦Силуфол* размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 20 мкл раствора

61

А, в правом верхнем углу наносят 3 мкл рабочего раствора охра-токсина А для ТСХ (15 нг охратоксина А). В левом нижнем углу на расстоянии 1,0; 2,0 и 3,0 см от левого края и 1,5 см от нижнего края пластинки наносят 1,3 и 5 мкл рабочего раствора охратоксина А (5,15 и 25 нг охратоксина А соответственно). Развитие пластинок в 1-ом и 2-ом направлениях проводят как описано выше. После сушки пластинки ее опрыскивают насыщенным раствором карбоната натрия в воде и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта охратоксина А с интенсивностью флуоресценции пятна охратоксина А в образце оценивают количество нг охратоксина А в нанесенном на пластинку объеме раствора А (ш).

Концентрацию охратоксина А в образце рассчитывают по формуле:

Vi — объем хлороформа для экстракции образца в мл (125 мл); V2 — объем хлороформного фильтрата, взятый для анализа в мл (50 мл);

Уз — объем экстракта (раствор А для ТСХ) в мкл (400 мкл);

V4 — объем экстракта (раствор А), нанесенный на пластинку в мкл (20 мкл);

m — количество охратоксина А в пятне, в нг;

М — навеска образца, взятая для анализа, в г (25 г).

При проведенных в скобках объемах и навесках формула концентрации охратоксина А в образце выражается следующим образом:

С* 2,0 т мкг/кг

Если интенсивность флуоресценции пятна охратоксина А в экстракте выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 5 мкл рабочего раствора для ТСХ (25 нг охратоксина А), то на пластинку следует либо нанести меньшее количество экстракта (уменьшить объем V4), либо разбавить раствор А смесью бензол—уксусная кислота (99:1), т. е. увеличить объем Уз, внеся соответствующие коррективы в расчетную формулу.

62

СОДЕРЖАНИЕ

I    МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ    *

1.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах методом тех.................................... 3

2.    Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с

помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии    ...    11

3.    Методика определения афлатоксинов в продуктах животного

происхождения ................................. 19

4.    Методика определения содержания патулииа в фруктовых и

овощных соках и пюре............................ 26

5.    Методика определения мпкотоксина патулииа в продуктах

переработки плодов и овощей ....................... 31

6.    Методика определения зсарпленопл в пищевых продуктах    ....    37

7.    Методика определения дсзоксинивалспола (вомитокспна) в    зерне

и зернопродуктах................................ 41

8.    Методика определения дсзоксинниллснола и зсараленона в зерне

и зернопродуктах ............................... 45

9.    Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и

продовольственном сырье.......................... 53

10.    Методика определения охратоксина А в пищевых продуктах ...    57

11.    Методики определения мпкотокеппои: Т-2 токсина, зсараленона

(Ф-2) и охратоксина А............................ 63

II. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ 77

12.    Атомно-абсорбционные методы определения токсинных элементов в пищевых продуктах и пищевом сырье.............. 77

13.    Методика определения мстил-этилмсркурхлорида в пищевых

продуктах, кулннарно обработанных ................... 93

14.    Методика определения содержания общей ртути в пищевых

продуктах методом беспламенной атомной абсорбции....... 97

15.    Методика по определению хрома в овощных консервах...... 103

16.    Методика определения содержания гистамина в рыбопродуктах

(флуоромстричсский метод)......................... 105

17.    Метод выделения, идентификации и количественного определения

гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)...... ПО

18.    Методика определения нитратов и нитритов в молоке и молочных

продуктах..................................... 114

19.    Методика определения жиратов и нитритов в плодовоощной

консервированной продукции........................ 124

биологических жидкостях .......................... 133

21.    Методика определения остаточных количеств

Эстрадиола-17/? в продуктах животноводства ............. 138

22.    Методика определения антибиотиков тстрациклинового ряда методом тонкослойной хромато<рафии (качественный анализ) ...    142

23.    Методика определения антибиотиков тетрацикл и нового ряда

<]»луоримстричсским методом (количественный анализ) ...... 143

24.    Определение летучих N-нитрозаминов в продовольственном сырье

и пищевых продуктах........................ .    .    .    ]4<з

1

   — Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и опре

делению содержания охратоксинаЛ в пищевых продуктах, утв. М3 СССР 10 апреля 1085 г. № 3245-85

57