ХАБАРОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ФАГОТИПИРОВАННЕ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Н ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ПРАКГННЕ

(Методические рекомендации)

г. Хабаровск, 1974 г.

Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения РСФСР

ФАГОТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

/Методические рекомендации/

Г.Хабаровск, 1974 г.

Фаготипы Вр В£* Cj и 41 по спектру чувствительности напоминают тип А, но отчетливо и с постоянством лизируются только гомологичными и групповыми фагами и поэтому выделены как самостоятельные фаготипы.

Новые типы, добавленные в последние годы, взаимодействуют только с гомологичными фагами.

Обычно считают, что для связывания фага и осуществления его действия на клетку в клеточной оболочке чувствительной бактерии должен находиться специфический рецептор.

У бактерий брюшного тифа отмечен параллелизм между чувствительностью н типовым фагам и наличием yi - антигена в культуре. Кауфман (1935) ввел термины у, w и w - формы для обозначения культур* содержащих разные количества Vi - антигена и не содержащих его.

Культуры, лишенные vi - антигена, относятся к w -форме, не лизируются VI - фагами и не агглютинируются vi~ сывороткой. В среднем такие культуры встречаются в 5-10%.

Вторую группу нотепирующнхся культур - составляют культуры, обладающие - антигеном, но резистентные ко всем используемым типам фага ^vi - Q. Такие штаммы именуются как ветепкрующиеся ^vi- штаммы. Причем в этой группе могут встречаться культуры:    ^а5-    к которым отсутствует гомоло

гичный фаг и нетепирующиеся культуры могут быть новыми*ещё неизвестными фаготипами.

б) к которым фаги серотипа Q не адаптируются даже после многократных пассажей. Такого рода культуры называют истинными i*perf*ct _ формами или гамма-формами.

10

И наконец* третья группа нетепирующихся культур объединяет по ли лиз абилыше    Vi - штаммы, проявляющие высокую

чувствительность я нзоколыши типовым фагам. Такие культуры называют ещё деградированными *i~ формами. Нередко при длительном хранении они превращаются в тип А, лизирующийся всеми фагами Vi - П. М.д.Крылова отмечает, что в литература посвященной вопросам фаготипярования, термин "деградация” штаммов употребляется в двух значениях: I) деградация как постепенная утрата культурой ^vi - антигена и переход его черев ^Vff -форму в ^v - форму м 2) деградация в смысл о потери специфичности штамма и превращения его в полиливабнльную культуру.

5. Феготммрованке бактерий паратифа А.

Метод фаготитрования бактерий паратифа А предложен в 1948 году Феликсом. Впоследотвии оа был развит и дополнен Банкером (1955).

Паратифозный А фаг был выделен из о точное вод в Бомбее и позволил подразделить культуры паратифа А на две группы. 1дап-тируя этот фаг к резистентным культурам, Банкер получил ещё 4 типовых фага. В настоящее время набор типовых паратифозных А фагов включает б типов. Аитическая актявнооть типовых фагов в омовении фа го типов представлена в таблице 2.

Фаго тип I лизируется всеми типовыми фагами, фаго тип 2 лизируется гомологичным фагом и в такой хо силе фагом 6, остальные 4 типа Высоко специфичны я лигируются только своими гомологичными фатами.

Культуры нечувствительны к типовым фагам принято обозначать как нетепируюцкеоя.

11

Обозначения: сд - сливной лизис

псд - полуоливвой лизис

++    +++    -    отдельные    стерильные    пятна    (до    50),

± - непостоянные реакции,

- - отсутствие лиэисн.

б» фаготипирование бактерий паратифа В.

Метод фаготнпироваКкя бактерий паратифа В разработан Феликсом и Кедлоу (1943-1951) по принципу Кредо и Иена* Этот метод стандартизирован и рекомендован Международным

12

конгрессом для интернационального использования* По своей специфичности типовые фаги паратифа В сильно отличаются от фагов брюшного тифа. Специфичен по существу фаг 1₉ лизирующий только гомологичный тип I. Все другие фаги взаимодействуют с двумя и более фаготипами. Поэтому принадлежность культур в какому-либо фаго типу устанавливается по чувствительности к различным сочетаниям фагов, как к гомологичным, так и гетерологичным,

Литическая активность 10 стандартны! фагов в отношении фаго типов в общепринятой оейчао форме представлена в табл, 3.

Таблица 3

Схема фагопширования бактерий паратифа В

Обозначения: ол - сливной лизис;

«сд - неполный лизис; пел - полусливной лизис; мл - лизис со вторичным ростом; - отсутствие лизиса.

13

Кроне 10 основных типов и подтипов с помощью типовых фагов был определен целый ряд постоянных вариантов бактерий паратифа.В. Общее число отдельных типов, подтипов и вариантов, нэвеотных в настоящее время, превышает 30.

Существует и другой метод фаготипировання бвктержй паратифа В. - схема Схолтеноа, В качестве типовых фагов в этой схеме попользованы наряду с фагами Феликса и Келдоу ряд умеренных фагов одного серотина, во о различными спектрами литического дейотвия.

Схема Сходтеноа виявляет значительно больнее количество вариантов культур по сравнения оо схемой Феликса и X Келлоу, но она более громоздкая,

7. фаготяпхроваяие оадмонелл тификуриум

фаготипированио бактерий тифк муриум проводилось как прямым типироваяием, так к по чувствительности к стандартным фагам. Было составлено несколько схем фаготипировання. Наибояь-яее признание получил метод Феликоа и Келдоу, В предложенный ими стандартный набор входит 13 адаптированных типовых фагов,

14

8. Фаготипирование прочих салмонелл и других представителей семейства килечных бактерий

Известны схемы фаготипировавия для довольно многих видов салмонелл, патогенных для человека и животных*

Некоторые виды салмонелл подразделены по методу Креджи

и Иена путем определения их чувствительности к различным о “ фагам.

Дилиенген (1950,1952) с помощью неспецифическюс О - фагов различного происхождения установил фаготипы ж у салмонелл энтеритидис, Дублин, гдЛиирун галлинарум, пуллорум.

Смит (1951) набором специфических 0 - фагов типировал салмонеллы томпсон и описал фаготипы у салмонелл Дублин, которые отличались от фаготипов, описанных Лилиеыгеном.

Необычайно широкое распространение ореди салмонеллезных бактерий лизогении позйрляег проводить их типирование методом Бойда, основанном на подробном и всестороннем изучении выделенных из салмонелл фагов. Этот метод обеспечивает получение постоянных результатов, но является трудоёмким и длительным. Аткинсон с сотрудниками (1952 - 1957) предложили для фаготи-пирования салмонелл упрощенную модификацию прямого метода Бойда, основанную на определении круга литической активности содержащихся в бактериях латентных фагов в отношении стандартных индикаторных штаммов известных фаготшмв.

Способ типирования Аткинсона, как отмечают М.Д.Крылова 1961) и и.С.Товмасян (1964) имеет преимущество перед методом Бойда в том, что не требует точной идентификации выделяемых латентных фагов и более прост. По сравнению с методом Креджи и Феликса метод Аткинсона технически несколько сложнее.

На основании применения упрощенной модификации были разработаны охемы фаготипирования салмонелл; аделайде, бовис морбификане, Потсдам, вайкроз (Аткинсон, 1952-1957); Монтевидео (ТаЛю, 1957), дерби (Товмасян, 1964).

16

Известны попытки фаготипирования других энтеробактерий: шигелл и патогенных эшерихей.

Были выделены монофаги к шигеллам Ньюкасл (Маклер,

1949) и шигеллам Флексцера (Ягуд, 1956), которые помогают дифференцировать друг от друга культуры разных оеротипов.

Для фаготипирования шигелл Бонне предложена схема Хаммер-строме (1947,1949). В ней используют 12 фагов, изолированных из лизогенных культур, фаги дифференцируют только R.- форму шигелл Бонне. В.Й.Кузнецова (1956) предложила схему фаготипирования R - форм иияелл Бонне тремя изолированными иэ испражнений больных фагами позволяющий* дифференцировать 5 фаготипов.

Для шигелл Флеконера, Мульчик и СлоНек (1962) предложили

набор из 12 фагов, позволяющий подразделить этот вид на 40 фаготипов.

Берковици с соавторами (1967) предложили схему тилнро-вания шигелл Бойда при помощи 14 бактериофагов.

Попытки практического применения фаготипирования шигелл дали обнадеживающие результаты: в ряде случаев при помощи фагов удается подразделить серотипы на несколько фаготипов и облегчить этим проведение эпидемиологического анализа.

Однако существующие наборы фагов и схемы типнрованяя ещё не пр лучи ли всеобщего признания (коллекции типовых фагов нуждаются в расширении, а схемы тнпировавия - в уточнении)*

Николь, 1я Минор I, Ля МИнор С, Бутьо (1957) разработали схему фаготипирования патогенных эиерихий по чувствительности ж к 25 фагам, тесту Адександро и Коме и Н-антигену.

Им удалось дифференцировать серотип 0IIU4 HI2 на IX фаготипов, 055 В5 - на 10, 026 В6 - на 7. Фаготипы обозначены по названиям городов и стран, откуда они происходили.

Один из недостатков схемы Николя - преобладание некоторых фаготипов. Кроме того, фаготипирование эиерихий затрудняет известная нестабильность фаготипов на питательных средах из-эа диссоциации, особенно характерной для эиерихий серсЬгипа 026 В6.    f7

М.Д.Крылова (1962) для фаготюшрования патогенны! эша-рихий использовала другой метод - испытание на лиэогенность. Эта методика тилирования заключалась в проверке культур на присутствие умеренных фагов перекрестно друг на друге, с дальнейшем выявлением разных индикаторных культур. Автор отмечает, что типирование патогенных эшерихий путем испытания их лизогенных свойств перспективно.

9. Специфичность, стабильность и изменчи-восить фаготилов брюшнотифозных бактерий в лабораторных условиях и различных эпидемических ситуациях.

В настоящее время считается, что специфичность фаго-чувствительности бактерий в большинстве случаев детерминируется типоопределяющими умеренными фагами. Из брюшнотифозных фаготилов на индикаторном штамме типа А изолировано J8 умеренных фагов. Для 13 умеренных фагов была доказана типо-определяющая функция в бактериальной клетке.

Известно, что все фаготипы тифозных бактерий одинаково успешно адсорбируют на себе и гомо- и гетерологичные фаги - П, но лизируются только гомологичным фаГом. Процеос адсорбции фага бактериальными клетками коррелирует прежде всего с антигенной структурой клетки, и поэтому вое штаммы, содержащие Vi - антиген, должны адсорбировать ^vt - фаги. Полагают, что действие профага реалиаируется на последних этапах взаимодействия клетки и фага. Участие типоопределяющего профага в формировании специфичного фаготипа выражается в том, что профаг затрудняет внутриклеточный синтез гетерологичного фага Vi - п.

Потеря профага а также замещения одного профага другим влечет за собой VI- деградацию фаготипа, проявляющуюся в том, что он начинает лизироваться брльшим числом типовых фагов* Лизогенизация культур определенными сочетаниями умеренных фагов или при заражении штаммов латентными фагами, серо-

логически родственными фагу vi- П способствуют возникновению гамма - форм.

Культуры фаготипа Л не содержат профагов, интерферирующих с адаптированными фагами Vi - П - это универсальные индикаторные культуры, а фаг В является производным почти всех типовых брюшнотифозных фагов.

По глубине изменений походного фага при адаптации все препараты у%- П фага по структурной формуле Андерсона и Фрейзера (1955) разделены на 3 группы,

К первой группе причислены типовые фаги, подученные адаптацией фагов А, на штаммах, не содержащих типоопределяющих профагов.

Воздействуя на культуру А умеренными фагами, переводят её в новый тип. Таким путем были получены фаги: Cj , В^ , В₂ ,

* J. Oj,B .    1,*,»    Ы,    Т,    27,    52, При Обратных дао-

оажах на культуре А эти фаги быстро утрацивавт приобретенные литические свойства и реверсируют в исходный фаг А. Такие типовые фаги называют ненаследственно (фенотипически) измененными вариантами фага А,

Ко второй группе отнесены препараты, полученные адаптацией фага А на культурах, содержащих гнпоопределяющие фоги: Bj , Д₁ , Д₅ , Д₆ , К, 0, ц , 25, 26, 28, 29.

При обратных пассажах на штамме типа А литические свойства препаратов остаются неизмененными. Авторы считают эти фаги наследственно (генетически) измененными мутантами.

19

Одобрены Ученым Советом Хабаровского НИИ эпидемиологии и микробиолсгии и Хабаровским Краевым лабораторным Советом в качестве методических рекомендаций в помощь бактериологам и эпидемиологам Дальнего Востока*

Старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук - М.С.Ленкина

Редакционный совет Хабаровского НИИЭМ -А.И.Барышникова, И.Е.Троп, Н.й.Макаревич, С.Е.Шапиро, Л.А.Берета, А.В.Колганов, И.С. Старостина.

Общая редакция И.Е.Тропа

В третью группу включенй фаги Д₂ ,    , ^С2 • ^?2 *

31. Оди как и фаги второй группы получены адаптацией фага А на либогенных культурах. При обратном пассаже на культуре типа А эти фаги менялись, но не реверсировали в тип А, а приобретали качества нового фага.

Фаги третьей группы именуют гено - и фенотипическими мутантами*

Приведенная классификация препаратов фагов по структурной формуле позволяет установить степень родства или отличия различных фаготипов и помогает верно интеррДОвЗДДОЗ&ть результаты фаготипирования с учётом эпидемиологических данных.

Хотя в лабораторных условиях о помощью умеренных фагов в некоторых олучаях удается изменить фаготип итаймов, в природе это, по-видимому, происходит относительно редко, чем и обусловливается стабильность фаготипа.

О большой устойчивости фаготипов свидетельствую? наблюдения многих исследователей. Отмечено, что фаготип культуры не меняется в течение ряда дет как при хранении и пересевах в лаборатории, так и в организме больных и бактерионосителей. Фаготиповая метка - устойчивый признак бактерии.

Возможны исключения из этого правила.

Чаще всего изменчивость проявляется в расширении диапазона чувствительности бактерии к гетерологичным фагам, вплоть до перехода её в тип А. Наблюдается и обратный процесо -переход фаготип» А в более специфическое состояние, проявляющееся в потере чувствительности к отдельным фагам или переход в нетитрующуюоя форму ( v i*

20

В настоящее время метод фаготипирования бактерий брюшного тифа и паратифов получил широкое распространение и всеобщее признание как ценное оружие каждого квалифицированного эпидемиолога. В Хабаровский ШИЭМ неоднократно обращаются эпидемиологи и бактериологи Хабаровского края и других курируемых институтом областей (Магаданской, Сахалинской, Камчатской, Амурской) в связи с затруднениями при интерпретации результатов фаготипирования в эпидемиологическом обследовании.

Многие бактериологические лаборатории Дальнего Востока не располагают литературой по данному, практически весьма важному вопросу и ощущают в ней большую потребность. Монография М.Д.Крыловой "Фаготипирование бактерий" 1963, стала в настоящее время библиографической редкостью.

Настоящие рекомендации составлены на основании результатов мвого летних исследований завершенных в 1973 году и материалов региональной лаборатории ХНИИЭМ по фаготипированию патогенных бактерий, а также данных современной литературы. В них содержатся сведения об основных принципах фаготипирования бактерий, получении типовых бактериофагов, схемах фаготипирования патогенных энтеробактерий, о стабильности и изменчивости фаго-типов в лабораторных условиях и разнообразных эпидемических ситуациях.

Ознакомление с ними повысит эффективность использования метода фаготипирования в противоэпидемической практике.

Пособие рассчитано на эпидемиологов и бактериологов санитарно-эпидемиологических станций и бактериологических лабораторий лечебно-профилактических учреждений Дальнего Востока.

3

I. ВВЕДЕНИЕ

Дальнейшее снижение заболеваемости брюшным тифом и пара-тифами в нашей стране является одной из важнейших задач. На современном этапе борьбы с этими инфекциями заболеваемость приобретает в основном спорадический характер» при котором осложняется внявление источников и факторов распространения инфекции. В связи с этим требуется применение .более совершенных и тонких методов эпидемиологического обследования и анализа, способствующих исчерпывающему раскрытию всех звеньев эпидемического процесса, а следовательно, и целенаправленному проведению противоэпидемических и профилактических мероприятий при брюшном тифе и паратифах. К числу методов, вооружающих противоэпидемическую практику, относится фагогипирование, позволяющее обнаружить различия между бактериями внутри вида.

Схемы фаготипирования разработаны для многих видов бактерий, а для некоторых из них (возбудители брюшного тифа, пара-тифов А и Б, стафилококки) существуют международные схемы фаготипирования.

Международная практика фаготипирования показала, что для создания наиболее стандартных условий необходима централизация работы в крупных лабораториях.

В СССР централизация работ по фаготипированию патогенных бактерий осуществлена в 1964 году путем создания центральной научно-исследовательской лаборатории по фаготипированию при Тбилисском научно-исследовательском институте вакцин и сыворо-

4

ток и региональными лабораториями занимающимися фаготипирова-нием тифозных и паратифозных культур выделяемых почти на зоей территории страны»

2» Основные принципы фагогипирования энтеробактерий.

Современные методы фаготипирозания основаны на двух различных принципах» Первый - состоит в определении различий между бактериями по свойствам содержащихся в них умеренных фагов и основан на широком распространении среди бактерий лизогенных культур» Типирозание проводится путем выделения из культур умеренных фагов и изучения их по различным критериям: диапазону литической активности, серологическим свойствам, морфологии стериальных пятен, специфическим изменениям устойчивости к фагу при ливогенизации индикаторного штамма, термо-чувотвительности. Этот принцип был предложен Барнетом в 1932 году и носит название прямое типирование бактерий» Указанным способом подразделяют некоторые виды салмонелл, кишечные палочки. Следует отметить, что ценность метода фаготипирования в эпидемиологии (особенно в отношении энтеральных инфекций) часто определяется сроком в течение которого может быть получен результат.

Прямой метод фаготипирования трудоёмок и длителен, что, в известной мере, ограничивает его применение в практике.

Второй принцип заключается в изучении чувствительности культуры к определенным фагам. Поскольку этот метод выявляет дифференцирующее действие профага косвенно, в реакции клетки о типовыми фагами, его называют непрямым типированием.

5

Метод хеширования бактерий по чувствительности к фагам считается более перспективным и быстрым. Осуществляется он с помощью наборов типовых фагов и используется для типирова-ния многих видов микроорганизмов (стафилококки, протей, корчна-бактерий, бруцеллы и др.).

3, Получение типовых фагов

Типовыми фагами могут служить как вирулентные так и умеренные фаги.

Вирулентные фаги с типоустаназливающими свойствами могут быть выделены непосредственно из внешней среды (чаще из сточных вод) или экспериментально путем адаптации фага на отдельных группах фагоустойчивых культур,

В результате адаптации одного исходного фага обычно отбирают мутаЙЬ фагов по спектру литического действия. Такие фаги идентичны серологически и, как правило, в критическом тест - разведении лизируют только штамм гомологичного типа. Типовые фаги, полученные методом адаптации, используют в схемах типирования бактерий брюшного тифа,салмонелл, тифимуриум, паратифа А.

Типовые умеренные фаги, обладающие различными спектрами литического действия, выделяются из различных лизогенных культур. Как правило, такие препараты в критическом тест-разведении лизируют не только гомологичный штамм, но и некоторые гетерологичные.

6

Подобным способом получают типовые фаги для типирова-ния бактерий паратифа В.

Типовые фаги используют в максимальном десятикратном разведении фага, дающем сливной лизис гомологичного штамма. Необходимость разведения типовых фагов вызвана тем, что на плотной среде концентрированные фаги могут дать неспецифический лизис штаммов принадлежащих к гетерологичным фаготилам.

Центральной научно-иоследовагельской лабораторией по фаготилированию патогенных бактерий при Тбилисском НИИВС осуществляется производственный выпуск типовых фагов: возбудителей брюшного тифа (41 фаг в наборе), паратифа В (10 фагов), паратифа А (6 фагов). В стадии лабораторной разработки находится фаготипирование салмонелд тифимуриум, шигелл флекснера и Зонне.

§* Фаготипирование бактерий брюшного тифа

Классическая схема фаготйпирования бактерий брюшного тифа разработана Креджи и Иеном в 1938 году и основана на том, что культуры зтих бактерий, содержащие VI - антиген, с помощью специфических Vi - фагов подразделяются на ряд стабильных фаготипов. Эта схема принята Международным комитетом по фаготилированию.

Перечень типовых фагов и штаммов непрерывно пополняется.

В 1947 году было известно 24 типовых фага, в 1955 - 33, а в 1962 году на Международном конгрессе в Монреале было сообщено

7

уже о 72 фагах:

Фаготип А

3 подтипаЗ группы В (Bp В₂, Bj)

9    -    подтипов группы С    ( от    Cj до    С^)

10    -    подтипов группы Д    (от    _до    д ^

подтип - отсутствовал.

10 - подтипов группы Е (от Bj до Ejq),

5 - ПОТИПОВ группыF (отр J ДОР5),

Фаготипы g I U.

3    -    подтипа группы I (от l    j до    ij)

2    -    подтипа группы К    (Кр    К₂),

2    -    подтипа группы ь    (Ьр    ь₂)«

3    - подтипа группы К (Мр М₂, Mj ).

фаготипы № О, Т, 25, 26, 27, 28, 29, 32,35, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46.

НА IX-иеждународном конгрессе микробиологов в Москве официально включено ещё 12 новых фаготипов и подтипов, открытие которых овяаано о активной работой некоторых центров по фаготипированию.

Новые фаготипы: С™» Ctti ¹ I м

Ю» II»    ₅,    _Kj|

В 71 F в? ^ 2»⁴ 3*

В 1972 роду ив Международного центра по фаготипированию кишечных бактерий в Лондоне доктором Е.С,Андерсон в адрео региональной лаборатории ХНИИЭМ приоланы новые фаги: Д^,

Е_п , *    6,    «4,    « 5,    51,    52, 53, 54, 55,

8

В итоге всех этих дополнений современная международная схема фаготипирования бактерий брюшного тифа включает 92 типовых фага и представлена в таблице I*

Характеризуя типовые фаги и штаммы следует отметить, что все фаги в схеме серологически идентичны и предотавляют варианты фага vi- П типа А.

Штамм фаготила А чувствителен ко всем типовым фагам, тогда как фаг А является самым специфичным фагом, потому что лизирует только свой гомологичный фаготнп культур. Другие фаги, кроме культур свооко гомологичного фаготила, диэирувт такЛЪ и фаготип А.

Андерсон и Фравер (1955) очитают, что фаготип А являет-оя самым примитивным фаготипом в схеме, а фаг X А представляет собой природную форму ^vi фага П.

Объединение подтипов в группы В, С, Д, В,* и другие основано на том, что наймы о порядковым номером I (Bj, и т.д.) в критическом тест-разведенки четко лизируются гомологичным фагом, а также фагами всех других подтипов данной группы.

Штаммы всех остальных подтипов лизируются, как правило, только гомологичными фагами.

Исключения И8 этого правила редки. Так, например, тип С3И в критическом тест рааведении, кроме гомологичного хорошо лизируется фагом С₂, тип Д₃ - фагами С₂, Д₆, Д₈, Д9, В₉,

тип Т - фагом Т, 28, 39, 40 и тип 28 - фагом S и 28.