ШНИСТЁРСШО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исоледовательский противочумный институт "Микроб"

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

МЕТОД ШКРООБЪЕМНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ для адщишшции ХОЛЕРНЫХ вибрионов

Саратов 1988

ШШСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

Всесоюзный ордена Тр^ч,с,ового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб”

Начальник Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР

М.И.Нарк^вич 24 марта 1988 г*

ОДИЧЕСКИЕ РЕК0М0ЩЦИИ

МЕТОД МИКРООБЪЕМНОЙ РЕАКЦИИ АГГЖ!Т]ШЦИИ ДЛЯ ВДЕНТШИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Саратов 1988

- II -

Результаты реакции агглютинации при постанов, з ее микроме-тодом через 2» б, 18-20 ч и 2-3 еут оказалась идентичными, в связи с чем окончательную серологическую идентификацию в планшетках проводили через 2 ч после экспозиции в термостате.

Десятикратное повторение реагсции 26 штаммов холерных вибрионов микрометодом со всеми холерными сыворотками дало совпадающие результаты как по титрам» так и по характеру агглютинации, что говорит о стандартности метода»

При использовании этого метода расход агглютинирующих сывороток уменьшался в 10 раз» сокращалось время» необходимое для постановки реакции и ускорялся срок выдачи ответа» Описанный метод менее трудоемок» Экономический расчет затрат бакпре-наратов и рабочего времени на постановку 100 реакций показал» что микрометод дает экономию в размере 20 руб.

Метод прошел апробацию в лабораториях 4 противочумных институтов и 4 противочумных станций и получил положительную оценку при комиссионной проверке специалистов института ^мМикроб^и„ Чувствительность» стандартность» достоверность полученных результатов, воспроизводимость в практических лабораториях, высокая экономичность позволяют использовать этот метод для постановки объемной реакции агглютинации при изучении штаммов холерных вибрионов и их популяций по признаку эггдютинабель-ности.

Литература

I. Бененоон А., Аниса Г., Поль А» // Еюл« ВОЗ. - Женева, 1968» Т*38. - № 2. - С.260-270. - 2.Беневоон А., Аниса Г.» Мосли У. - Там же. - С.270-279. - 3. Вейнблат В.И. // Таз. докл. Всес.науч.практ. конф. - Ставрополь» 1983. - С.336-337.

HV5i6i£    Подписано к печати

Формат 60x84 Х/Х6* Печ. л, 0*75*

Тираж 600, Заказ ZQ&S Цена 15 коп.

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб”. Саратов* Университетская, 46

Саратов. Ротапринт типографии Ч б*

Микрититровальпая техника в настоящее время широко внедряет* ся в практику лабораторной диагностики многих инфекций. Это значительно экономит диагностические бактерийные препараты и рабочее время. Р методических рекомендациях описан метод постановки реакции агглютинации холерных вибрионов со специфическими агглютинирующими сыворотками в микрообъемах е использованием специальных полиетероловых планшеток для иммунологических реакций и микротитровальных игл» а также стерсомикро-скода с приспособлением для косого освещения. Вся реакция осуществляется в объеме 0,1 мл.

Методические рекомендации составили: Д.Д.Шмеркевич, Т.Н. Донская, Н.С.Огнева, Н.А.Маторина, О.С.Тр^шева, Н. II. Миронова, В.Г.Мацуга.

ВВЕДЕНИЕ

При бактериологической диагностике холеры ведущим признаком идентификации выделенной культуры является ее способность агглютинироваться специфическими холерными сыворотками (видо~ вой-0 и серологических вариантов - Огаэа и Шаба, а также К0-сдаороткой для диссоциирующих щташов).

Постановка развернутой реакции агглютинации с четырьмя сыворотками довольно трудоемка и требует использования большого количества пробирок {25 на каждый шташ) *

В методических рекомендациях предлагается ставить реакции агглютинации при диагностике холеры в микро объемах с использованием специальных полистероловых планшеток для иммунологических реакций* микротигровальных игл из набора мшсротитрато-ра Такачи к стереомикроскопа е приспособлением для косого освещения»

Предлагаемый метод менее трудоемок по сравнегшю с пробирочным, специфичен* чувствителен и стандартен* Его использование позволяет проводить окончательный учет через 2 ч после постановки реакции* Он дает экономический аффект по сравнению с пробирочнш методом - 20 руб* на каждые 100 реакций. Метод получил положительную оценку при комплексной апробации специалистами института "Микроб" * РШИ, ШШЧИ Кавказа и Закавказья, НШШ Сибири и Дальнего Востока и рада противотцтыных станций (10 актов внедрения).

Методические лазания предназначены для научных, производственных и практических лабораторий Гфотнвочумных институтов, станций и отделений.

- 4 -

I. ОБОРУДОВАНИЕ

1.    Полистерсловые планшеты для иммунологических реалий с прозрачными крышками,

2.    Иглы титровальш э объемом 0,05 ил из набора микротит-ратора Такачи.

3.    Диаотки-капельницы из того же набора*

4.    Пастеровские пипетки*

5.    Кюветы эмалированные, фаянсовые или стеклянные*

6» Стереомтсроскоп с приспособлением для косого освещения.

Я* МЕТОД ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

Сухую сыворотку растворях j дистиллированной водой и разводят в 0,85% растворе HaCl (pH 7,2-7,4).

Взвесь исследуемой культуры готовят в 3-4 мл 0,85% раствора NaCl из 6-18-ч^г совой агаровсл культуры, до концентрации

о

2-10 м.к* в I мл, что соответствует 10 единицам стандарта мутности ГИОКа км.Я.А.Тарасовича.

Пластинки (предварительно отмытые и хорошо просушенные) маркируют, надписывая с лорой стороны карандашом номер исследуемого штамма, наименование сывороток, а сверху ставят раз-ведение сывороток (1:100, 1:200 и т.д. до рабочего титра).

В луночки каждого ряда пастеровской пипеткой вносят по 0,05 ил (2 капли) 0,85% раса-вора хлористого натрия. Затем в первую лунку вносят 0,05 ш соответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят двукратны© ее разв дения микротитровальной иглсй из микро*..-тратора Такачи объемом 0,05 мл. Из последней луночки 0,05 мл сыворотки удаляют этой жэ иглой, помещая ее в 36° спирт с последующим обжиганием* После тктрации всех сы-

- 5 -

вороток в каждую лунку вносят пастеровской пипеткой 0,05 т

о

взвеси исследуемой культуры в концентрации 2*10 м.к. в I мл*

Пластинку накрывают крышкой и ставят в термостат при 37°С на 2 ч, после чего проводят учет реакции в косо проходящем свете под стереомикроскопом MBC-I или МЕС-2*

Ш_# УЧЕТ РШЩШ

Реакцию оценивают г' четырехбалльной системе, просматривая пластинки под микроскопов

+-Н-+ (4+) - полная агглютинация - наличие на дне лунки рыхлой разорванной плетней, четких хлопьев на фоь^ темного поля;

-н-ч- (&-) - неполная - наличие нежной пленки и полиморфных комочков агглютината на темном фоне;

-и- (2+) - слабая - наличие мелких хлопьев на фоне сероватого поля;

ч- (1ч*) - следы агглютинаций - единичные мелкие хлопья на фоне мутной жидкости*

Реакцию оценивают отрицательно, когда в луночке вибрионы равномерно выстилают дно или собираются в "пуговку** Под микроскопом видно равномерное мелкозернистое поле без томных промежутков*

Положительной считают реакцию при наличии агглютинации (не менее чем на

К V.choleras 01 ( cholerae , eltor) относятся культуры, агглютинирующиеся сыворотками 01 до диагностического титра*

Серовар культуры вибриона определяют по ее взаимодействию в реакции агглютинации с типоспецифическими сьгоротками Огава и Инаба не менее чем до 1/2 титра сыворотки,. Культуры, реагирующие с сыворотками обеих вариантов не менее чем до 1/2 титра, относятся к серовару Гикошима.

При выполнении исследования возможны сшибки в случав недостаточной чистоты микротитровалышх планшеток* исчерченнасти лунок, а также неполного заполнения микротитровальных игл при титрацин сывороток*

Противопоказанием для применения данного метода является отсутствие условий для выполнения требований противоэпидемического режима работы»

ТУ. РЕЖИМ РАБОТЫ ПРИ ПОСТАНОВКЕ РЕАКЦИИ

АГГДетИНАЦШ! ХОДЕРГЫХ ВИБРИОНОВ ШСРОМИОДОМ

Работа проводится в костюме 4 типа, дополненного резиновыми перчатками*

Реакцию ставят в микрообъемах, используя микротитровадь-гшо планшетки дня иммунологических реакций объемом 0,4 мд.

Подготовка планшеток и титрация холерных агглютинирующих сывороток 0, Инаба, Огава, RO проводится на чистом столе.

Дальнейшую р боту осуществляют с соблюдением Инструкции о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний Х-Д групп (Саратов, 19*79)* Дополнительно предусматривают следующее.

Микротитрозальныв планшетки помещают на поднос (эмалированный, стеклянный, фаянсовьй)• Ка дно подноса предварительно расстилают марлевую салфетку, смочены**» дез раствором (3% раствор хлорамина, карболовой кислоты)*

После этого в каждую лунку пипеткой-капельницей вносят 0,05 мл взвеси холерных вибрионов в дозе 2*10^ м.т*/мл.

Затем микротитровальную планшетку нагфывают крынкой и на подносе ставят в термостат при 37°С на 2ч*

При проведении учета реакции поднос с микротитровальной

- 7 -

планшеткой перенося® на лабораторный стол; планшетку ставят на стеклянную подставку и просматривают в косо проходящем свете с помощью микроскопа М^О-1 (МБС-2),

При ytxQTe реакции крышку с мичротитровольной планшетки не снимают, В случае запотевания кршки ее меняют на другую, а запотевшую помещают а емкость с Т% раствором хлорамина. После учета реакции планшетку и крышку складывают в кювет, заливают х.орам$шом)₉ накрывают и оставляют на 24 ч. Б этом случае необходимо обратить внимание, чтобы все лунки пластинок были заполнены дезраствором. Если имеются пузырьки воздуха в лунках, необходимо осторожно погрузить пластинку в дезраствор, манипулируя при этом пипеткой, которую обеззараживают в дезрастворе= Стеклянную крышку столика из-под косого освещения обрабатывают 70° спирты.

- 8 -

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАШСКА

к методическим рекомендациям "Метод микрообъемной реакции агглютинации для идентификации холерных вибрионов'^!

Реакция агглютинации при лабораторной диагностике холеры широко применяется для идентификации и изучения выделенных штаммов холерного вибриона. Каадый шташ согласно Инструктивно-методическим указаниям по лабораторной диагностике холеры (Москва, 1984) должен быть проверен в развернутой реакции агглютинации с агглютинирующими видовыми О и Ш - сыворотками и типоспецифическими Огава и Инаба сыворотками. Это требует большой затраты рабочего времени, расхода бактерийных препаратов и бактериологических пробирок. Для изучения 25 штаммов (100 реакций агглютинации) требуется затратить полный рабочий день одного лаборанта,

1/2 рабочего дня врача, израсходовать 150 мл агглютинирующих сывороток (Х;Х00), 625 пробирок. С учетом подготовительной работы и последующей работы по обеззараживанию пробирок, их мытью, пробке ;анш и т*д. яснокак загружает эта работа все подразделения бактериологической лаборатории,

В представленных методических рекомендациях описан видоизмененный и усовершенствованный метод (1-3) постановки реакция агглютинации холерных вибрионов со специфическими агглютинирующими сыворотками в микрообъемах с использованием специальных по-листероловых планшеток, вышедших из употребления после иммуно-ферментного анализа и шкротитровальных игл из микротитратора Такачя, а также стереоыикроскопа с приспособлением для косого освещения. Вся реакция осуществляет л в объеме 0,1 мл.

В целях обеспечения безопасности работы составлено наставление по соблюдению требований противоэпидемического режима при

- 9 -

выполнении этого метода, которое одобрено режим* Ш комиссией и утверждено директором института "Шкро^ ’ 29 мая 1984 г.

Исследования показали, что все холерные вибрионы классического и эльтор биоваров агглютинировались холерной видовой 0-сывороткой в микрообъемах. В пробирках реакция агглютинации зарегистрирована в 90% случаев (таблица).

Что касается агглютинабельности типоспецифическими сыворотками, то прослеживается следующая закономерность: при постановке с сывороткой Инаба в ыикрометоде агглютинировались 100, а в пробирках - 90% штаммов классического холерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы биовара эльтор ееровара Инаба агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров ееровара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.

Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с ф-еывороткой наибольшее число штаммоз (4), агглютинирующихся 50-сывороткой до титра, было выявлено в микрсметоде ; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма (таблица). Очевидно, это объясняется тем, что при учете реакции агглютинации под стереошкросколом увеличивается возможность улавливать наличие мелкохлопчатого агглютината, который не виден простым глазом.

Все штаммы вибрионов 040-056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирую1рш сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040-серовара) агглютинировался всеми холерньлч* сыворотками.

Большинство изученных штаммов представителей семейства Bnterobaoteriooeae также не агглютинировались холерными