ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САЮПАРНО-ЭПВДШШОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИШУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЯЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

Методические рекомендация

г.Екатериибург

1995

ГОСУДАРСТВЕННЫ!! КОМИТЕТ САНИТЛРНО-ЭШЩЕ.МИОЛОГИЧЕЖОХ'О НАДГОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УТВЕРЖДАЮ:

Заместитель Председателя Госкомоанэпиднадзора РФ

Г.Г.Онищенко

" 28 " ноября 1994г.

ШМУНОТЛЮОРЬСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ШЗШАЕШХ ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

Екатеринбург, 1995г,

Методические рекомендации составлены на основе многолотого опыта Екатеринбургского НИИ сирусных инфекций по разработке и внедрению люминесцирупцего препарата для диагностики заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса. Препарат выпускается с I98S года и нашел широкое применение в работе вирусологических лабораторий санэпидслужбц и здравоохранения.

В рекомендациях представлены способы взятия материала, правила приготовления и окраски мазков, их просмотр и интерпретация результатов.

Соотавитоли: Оавушкина В.К., Нефедова О.А., Астаненков О.П., Глиноких Н.П.

Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов центров госсанэпиднадзора, НИИ и клиник, занимающихся диагностикой герпетической инфекции.

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных ни-fo юш!,

ВВЕДЕНИЕ

Герпетическая инфекция занимает большое место в инфекционной патологии человека. Вирус простого герпеса (ВПГ) вызывает кератиты, конъюнктивиты и увеиты, энцефалиты и невриты, стоматиты и гингивиты, экземы и дерматозы, лоражония слизистых 176» гортани, глотки, пищевода, половых органов, а также изменения внутренних органов. Установлено значение ВПГ вс внутриутробной патологии плода и заболеваниях новорожденных, нередко заканчивающихся летально. Всо более подтверждается этиологическая роль НИ Г при злокачественных новообразованиях человека.

Герпетическая инфекция протекает в острой и хронической Формах, являясь, по-видимэчу» самым распространенным вирусным заболеванием человека, с большим разнообразием как клинических проявлений, так и тяжести течения. Такое многообразие процесса по локализации и клиническим проявлениям, наличие необычных, атипичных и стертых форм, длительное иоситольство вируса соэда-ют повсеместно больше трудности в диагностике заболевания. В связи с этим значительная роль принадлежит лабораторной диагностике. Однако вирусологические и серологические исследования трудоемки, длительны, носят ретроспективный характер и для большинства практических лабораторий недоступны. Поэтому наиболее подходящим экслресо-мотодэм диагностики герпетической инфекции является метод кммунофлюэресценции (ИФ), позволяющий дать ответ в день взятия пробы, практически через 2-3 часа.

I. Техника взятия материала и приготовления препаратов

Необходимы: стерилыше ватные тампоны на палочках, пробирки о 1,5-2 мл забуферепного физиологического раствора (pH 7,2-7,4), скальпель, фолькмановская ложка, обезжиренные предметные отекла, охлажденный химически чистый ацетон,

В связи с разнообразием локализации поражоний техника взятия материала несколько варьирует.

Генное губ и носа. Материал забирают стерильным ватным тампоном с характерных везикул и делают отпечаток на предметном стекле. Тампон можно также тщательно промыть и отжать в 2 мл физраствора, который затем отцентрифугировать, а из осадка при-

3

готовить мазок.

Поражения кожи и видимых слизистых. Материал забирают аналогично вышеописанному.

Острые и хронические стоматиты и гингивиты. Клетки плоского эпителия полости рта снимают 3-4-кратным проведенном ватным тампоном с небольшим усилием как с участков поражения, так и о непораженной слизистой. Готовят мазки-отпечатки с тампона, а также яооле промывки его в физрастворе и центрифугирования - из осадка.

Острые и хронические кератиты и конъюнктивиты. Соскобы о ломошью небольшого тупого скальпеля берут с конъюнктивы верхнего в нижнего век и верхней переходной складки при двойном ее вывороте после предварительной инстилляции 0,5^-ного раствора дпкална. Стерилизацию скальпеля осуществляют троекратным погружением его в этиловый спирт и прожиганием на спиртовке. Материал растирают на предметном стекла другим стеклом.

Герпес половых органов. Материал для исследования берется оо дна везикул и эрозии с помощью фолъкмановокой ложки или скальпеля. Мазки готовят путем растирания на предметном стекле.

При сочетании герпеса с ОРЗ материал для исследования забирают стерильным ватным тампоном из нижнего носового хода. При этом вводят гампон легкими вращательными движениями на глубину около 3 см от края носового отверстия, слегка сжимая крылья носа. Можно сделать отпечатки тампоном на предметном стекле или поместить ого ъ пробирку о физраствором, хорошо ополоснуть, отжать, раотвор отцеитрнфугкровать, а из осадка приготовить мазки.

ГвРЛвтмадкий этюФадит иди шишп’ознпсФялит. Взятую при пункции спинномозговую жидкость центрифугируют и из осадка готовят мазки на предметных стеклах;

Секционный материал. Кусочки внутренних органов, спинного п головного мозга размором 1-3 куб.см иссекают по возможности в более короткий сроки. С них делают отпечатки на хорошо обезжиренных предметных стеклах,

Пр-Иготозлатте клеточных тоот-пропаштов.

Ьсо иышвпорочислешшо материалы можно использовать и для заражения клеточных культур. В этом случае в материал сразу жо добавляют смесь антибиотиков; 5000 Ед/мл пенициллина и по 1ию Ед/мл стрептомицина и микостатина. Наиболее доступной и достаточно чувствительной является клеточная культура фибробластов

4

эмбриона человека (ФЭЧ). Клетки ФЭЧ, полученные трипсинизацн-ей пс общепринятой методике, разводят в 0,5^-ном растворе гидролизата лактальбумша с 10$ нативной сыворотки крупного рогатого скота, разводят до I млн. клеток в объема I мл и разливают в пробирки о покровными стеклами (ICbcIB мм). Через 48-72 часа сформированный монослсй клеток заражают исходным материалом по 0,1 мл на пробирку, используя в качестве среды поддержания среду 199 (pH 7,6). На каждую пробу материала берут по 4 пробирки.

Оценка результатов проводится по 4-х плюсовой системе.

После наступления дегенеративных изменений в клетках хотя бы на 1(+) стекла извлекают, ополаскивают в забуференном растворе (pH 7,4) и подсушивают при комнатной температуре (18-20°С)*

Срок наблюдения за проявлением цитопатического действия (ЦДЛ) - 7 суток.

Все приготовлешше препараты - мазки, отпечатки, стекла с клетками - фиксируют в охлажденном химически чистом ацетоне 10-15 минут при комнатной температуре или в рефрижераторе (+4 +6°С).

2. Флюоресцирующие иммуноглобулины и проверка их красящих свойств

Для окраски приготовленных препаратов используют флюорбоци-рунцио иммуноглобулины в рабочем разведении. Указанное на этикетке разведение является в определенной мере ориентировочным, поэтому рабочее разведение рекомендуется подбирать опытным путем.

Проверку красящих свойств флюоресцирующих иммуноглобулинов производят на клетках ФЭЧ, эаряжэтгых и незаряженных вирусом. Клетки ФЭЧ готовят и разливают в пробирки с покровными стеклами, как описано выше в разделе I. По достижении монослоя в опытные пробирки вносят по 0,1 мл вируссодержащей суспензии эталонного штамма вируса простого герпеса. После начала дегенерации на один плюс стекла извлекают, споласкивают в забуференном Физрастворе и подсушивают при комнатной температуре. Таким же образом готовят контрольные невыраженные клетки ФЭЧ на покровных стойлах. Оба типа препаратов фиксируют в охлажденном химически чистом ацетоне.

5

Зараженные и незараженные стекла монтируют на предметном стекле при помощи полоски лойколластцря, Готовят двукратные разведения флюоресцирующих иммуноглобулинов на забуфереином физрастворе с добавлением родамина, меченого альбумином в рабочем разведении, указанном на этикетке. Но капле каждого разведения наносят па 2 зараженных и 2 нозараженных стекла, выдержи-ватт их во влажной камере (чашка Потри с увлажненной фильтровальной бумажкой на дне) 30 минут при 3U°C. Затем промывают в двух сменах эабуференяого физраствора (pH 7,2-7,4) по Ш мщч и споласкивают дистиллировшшой водой.

Готовые препараты просматривают в люминесцентном микроскопо МЛ-2, МЛ-3, f/ЛД, ЛЮМАМ с нефлюореегшрушим маслом (объектив МИхЭО, окуляр х5) или дистиллированной водой (объектив ВНх70, окуляр хЗ) и фильтрами: ФС-1-2, СЗО-7-2, БС-15-2 и запирающим фильтром - 2.

В контрольных незаряженных препаратах наблюдается слабое желтоватое свечение, а в зараженных - в ядре и режо в питоллаь мо клеток выявляется желто-зеленое специфическое свеченио. Последнее разведение флюоресцирующих иммуноглобулинов, при окраске которым в клетках наблюдается отчетливая специфическая флюоресценция, ясно отличающаяся от свечения контрольного препарата, считается красящим титром. Лля окраски мазков от больных используется рабочее разведение - в два раза концентрированнее красящего титра.

3. Техника окраски препаратов, предназначенных для выявления и идентификации ВПГ

Фяксйровшшые препараты помещают во влажную камеру, на них наносят no 1-2 капли флюоресцирупцих иммуноглобулинов в рабочем рпзродопии, выдерживают ЗУ минут при 37°С, промывают в двух сменах охлажденного до +4°С забуфоронного физраствора*' (pH 7,2-7,4) по 10 минут и ополаскивают дистиллированной водой.

Методика приготовления забуфереююго физраствора (pH 7,2-7,4)t

A.    В 2,7 л дистиллированной воды растворить натрия фосфорноки

слого двузамещенного (NaoHPO.) - 4.50Г, натрия хлористого {Watt ) - 22,95г.    “    ⁴

B.    В 0,3я дистиллированной водн растворить калия фосфорнокис

лого 0ДН00Ш.'«1Ц01'Н0Г0 (КНсРОл) - 0,41г, натрия хлористого (HaCl У - 2.55г.    ^6    4    „

В. К раствору А добавить раствор F- порциями, перемешивая я контролируя pH до получения 7,2-7,л.

6

Изложенный режим окраски обеспечивает оптимальные условии для проникновения ^шооресцируицих иммуноглобулинов в клетку, соединения их с антигеном it удаления непрореагировавштс флюоресцирующих антител.

4. Микроскопия препаратов и оценка результатов

Окрашенные препараты просматривают в люминесцентном микроскопе типа: МЛ-2, МЛ-3, МЛД, ЛШАМ в падающем свете с фильтрами ФС-1-2, СЗС-7-2, БС-15-2 и запирающим - 2. При просмотре пользуются нефлюоросцирующим маслом (объектив МИхЭС, окуляр х5) или дистиллированной водой (объектив ВИх70, окуляр х5).

Просматривая препараты, обращают внимание на количество и строение клеток, наличие сличи, лейкоцитов, клеточного детрита. Во избежание ошибочных результатов учитывают лишь клзтки с сохраненной структурой (четко различимыми ядром и цитоплазмой) и ясно видимой желтовато-зеленой специфической флюоресценцией в ядрах, реже - в цитоплазме клеток. Положительный результат регистрируется, если в препарате содержится не менее трех клеток с флюоресцирующими включениями. Свечение слизи, лейкоцитов и клеточного детрита но имеет диагностического значения.

В повседневной диагностической работе в качеотве контрольных используют препараты, приготовленные из материала того же больного, но окрашенные флюоресцирующими иммуноглобулинами к другим вирусам. При этом необходимо помнить о возможности обнаружения смешанных форм вирусной инфекции. М диагностика наиболее эффективна при обследовании больных в острой стадии и в более ранние сроки. В стадии выздоровления обнаружить вирусный антиген, как правило, не удается.

7

Отрывной лист учета эффективности использования методических рекомендаций

Направить в отделение планирования и внедрения Екатеринбург-

окого НИИ вирусных инфекций (620030, г.Екатеринбург, ул. Летняя,23),

1.    Методические рекомендации: "Иммунофлхюресцентная диагностика заболеваний, вызываемых вирусом простого герпеса”.

2.    Заместителем Председателя ГК СЗН РФ Стшенко Г.Г. 2H.II.94r.

(коми когда утвержден)

3.    _,__,_

(кем и к ох’да получен)

4.    Количество центров госсанэпиднадзора и лечебно-профилактиче

ских учреждений, которые внедрили метод диагностики, предложенный данным документом _

5. Фермы внедрения (семинары, подготовка и переподготовка специалистов, сообщения и пр.) и результаты применения метода (количество наблюдений за I год и эффективность)

6, Замечания и пожелания

Подпись _ ■    ■    -    -

(должность, Ф.И.О. лица, заполнившего карту;

ШШОФЛШРЕСЦШШЯ ДИАГНОСТИКА заболевании, шзнвашл ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

Методические рекомендации

Лицензия на издательскую деятельность ЛР JA 020672 7 декабря 1992 г.

ПОДПИСАНО К ПЕЧАТИ 29.08.95 г. ФОРМАТ 60 X 84 I/I6 ОБЪЕМ 0,5 ПЕЧ.Л. ТИГА1 300 Экз. ЗАКАЭаи