Министерство здравоохранения СССР Ростовск ий-на-Дону Государетвенный научно-исследовательский противочумный илотитуг Всесоюзный ордена Трудового Краоного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

110 СЕРОЛОГИЧЕСКОМУ ТИГЛРОВАНШ ВИБРИОНОВ НЕ АГО1ШШ>УЮЩИХСН О-ХОЛЕРНОЙ СЫВОРОТКОЙ

Саратоб

1980

Министерство здравоохранения СССР РостозскиП-яа-Дону Государственнуй научно-исследовательский противсчу/.ншй институт Всесоюзный ордена Трудового красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт •^йкроо"

^,7Та^А«УЫ^и

заместитель начальника Главного управления.карантинных инфекций ^ннистерства^з^равоохранен^

ОЙ. 04.80г.    Л.М.;«АРЧУК

JuBTQAMBJKKB УКАЗАНИЯ

но СЁР0лог1;ЧйС4\0шУ тэдкРивАил вырионов,

ПК AlTJMTiliP/uiJiXOa О-ХОЛВРНОЙ СЫВОРОТКОЙ

Саратов

19Ь0

В методических указаниях описан способ серологической дифференциации вибрионов, не агглютэдг.руюдпхся холерными сыворот-ках/.и CilAT-BiicpHOHoa), ранний способ предусматривает постановку ориентировочной реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой, объемной агглютинации со смесями типовых сывороток и определение типовой принадлежности атаммов Ь'АГ-вибрпонов путем постановки реакции агглютинации с типовыми сыворотками, входлдимм в состав смеси, которая дала положительную реакцию.

йены тан ия поливалентной, групповых и типовых спзоро.тск

проводились в научно-исследовательских ноot:ibcчумных институтах ("микроб", Рост овский-на-Дону, Кавказа и Закавказья, Иркутский) , противочумных станциях (ленинградская, одесская, Узбекская, Туркменская, Крымская и другие), в лабораториях санэпидстанций Саратова, Николаева, Ростова-на-Дону, Запорожья, йз всех указанных научных и практических учреждений получены положительные заключения.

Способ серологической дифференциации НАГ-вибонснов может оыть аироко использован для диагностики и эпидемиологического анализа острых ккмечиых заболеваний, вызываемых НАГ-вйорпоиам.и.

Методические указания составлены А.К.Адамовым, л.Г.Зоронек-ской, Г.Ь.Гальцевой, Г.М.Мединским, л.^.Сцслнкоьон, А.Г.Сомовой, ГД.УСОБЫА'., jj* л.шурк ян ой •

b Ь п Е н и £

микроорганизмы, сходные с возбудителем холеры по морфологическим, культуральным и основным биохимическим свойствам, но не агглютинирующиеся холерными сыворотками, широко распространены в природе. Установлена этиологическая роль НАГ-вибрионов в воз-н.иснооешш острых килечных заболеваний у ладей.

^АГ-вибрионы неоднородны до антигенной структуре. Они обладают термоласильным жгутиковым и термостабильным ооматичеоким антигенами. Наличие различных тидоопецифг.чеоких компонентов в составе о-антпгенного комплекса у разных штаммов НАГ-вибршшов позволяет разделить их на оерологпчеокие варианты и дифференцировать пАГ-висриони от холерных визрионов, которые относятся к 01 серогрупле.

о ССОР создана коллекция типовых штаммов НАГ-виорионов, включающая 38 (ОЗ-ОЗУ) из коллекции Р.Саказаки; 5 (040 - 044) -описанных ю.П.ыуркиной и А.К.Адамовым; II - описанных А.Е.Аиоин-зон, Г.п.Гальцевой, А.Г.Сомовой, ^.Г.Зсрснелской и др. (045 -055); I - и56 (i-.А.Ннятханов с соавт.) - есего 55 штаммов.

Антигенное родство между отдельными 0ьрс/'руп.да1Ш (4 и Ь;

Z v. у; 3,ii и 13 и 23; 14 и 36; 10,16 и 24 и ряда друх*их) уштываетоя при изготовлен из смесей типовых с-сывороток.

Сыворотками к указанным 55 типовым штаммам агглютинируется солее 7j* культур САГ-ви^рионов, выделяемых от больных острыми коечными заболеваниями и висриононосителей НАГ-вибрионов. Иа-и олее часто встречаются впорконы о5, 02, Ob, 024, 034, 047, 050

и

и некоторых других оерогрусд.

ХАРАК1ЬР ЙЗТ Ж A НАГ-БкдР ИОНОВ

Серотипированию подлежат культуры, идентифицированные кок представители ряда Vibrio^ не агглютинирующиеся холерными сыворотками, НАГ-вибряоны обладают окспдазной активностью, расден-ляют глюкозу в среде Хью и Лейфеовэ о образованием кислоты оез газа в аэрооннх и анаэробных условиях, декарбоксилируют лизин и орнитин, не имеют . игидролаэы аргин на, расщепляют маннит, инактивны к инозиту, относятся к I или il группам Хей-берга, разжижают желатину, восстанавливают нитраты ь нитриты, опоообны образовывать индол, не продуцируют сероводород, не Обладают уреазной активностью, не фосфоресцируют.

В свете современных таксономических критериев микроорганизмы, сходные о вибрионами по морфологическим свойства//., но ферментирующие углеводы до типу Ш - УШ групп Хейберга, к НАГ -вибрионам, как правило, не относятся.

Культуры ifAT-вибриолоБ, отобранные для типирсвания, следует выращивать на питательном агаре (млсоиептоиком, Мартена или из перевара сердечной мыдцы, pH 7,6 - 7,8) в течение 18-20 ч при 37°. Б качестве антигена дли реакции агглютинации на стекле используют оуточные агаровые культуры, а для объемной агглютинации - взвеои в (физиологическом растворе С pH - 7,2) этих культур, содержащие в I мл I млрд. м.к. по оптичес.чому стандарту мутности ШЖ им. д.А.Тарасевича.

КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О HALOPE АГГМСШ^УШИХ СЫВОРОТОК

Диагноотичеоние О-агглютинирующие типовые оыворотки против 55 серотипов НАГ-вибрвонов получают иммунизацией кроликов культурами типовых штаммов НАГ-вибрионов из коллекция Саказаки и обнаруженных на территории СССР.

В качеотве антигена для иммунизации применяют взвеои оу-точных агаровых культур, уоитых кипячением в течение 2 ч. Животным вводят внутривенно 1,2,4 млрд. м.к. в объеме одного мл о интервалами 5-6 дней, или подкожно - первая и вторая инъекция по 20 млрд, м.к., а третья - внутривенно 5 млрд. м.к. о интервалом в три дня. Если спустя. 7 дней после последне-й инъекции в сыворотках обнаруживаются агглютинины в титрах 1:1600 - 1:3200, то кроликов обескровливают. Ирл низких титрах делают внутривенно 2-3 дополнительные инъекции в дозе 4-5 млрд. м.к. В случае Обнаружения в оыворотках групповых антител их адсорбируют фор-малшшзированными микробными взвесями соответствующих штаммов в концентрации от 50 до 2QJ млрд. м.к. на 1 мл сыворотки, разведенной 1:5.

Оыворотки выпускают в стандартных разведениях -в I/10 диагностического титра по отношению к вибрионам гомологичного серотипа.

Учитывая оольjoe количество серотипов, предлагается XI смесей типовых сывороток для предварительного исследования. Смеои 1, и, Ш, УН и X используют в виде готовых препаратов, состоящих из сывороток против вибрионов трех - шести серотипов. Остальные шесть смесей и/,У,У1,УШ,1Х и XI) приготавливают непосредственно

перед употреблением, включая в их состав в равных объема:; оять - шесть сывороток, указанных н ше. Ооъегк соединяемых сывороток определяют в зависимооти от количества наследуемых штам-мов из расчета 0,5 мл смеси на одну культуру.

ii 1,11,Ш а УШ смеси входят сыворотки к н'ЛГ-аиорконам, которые наиболее часто встречаются на территории Советского Союза.

Кроме того, для ориентировочной агглютинации на стекле предложена диагностическая взорионная О-агглютинирующая поливалентная сыворотка, полученная путем смешения сывороток против впорг.онов ЗЬ серотипов коллекции Саказаки и 40-го серотипа,

СЬРиЛиГ*.4 ЬХЗлАл iviiuiТ< 'лчHi

Исследуемую культуру сначала изучают в реакции агглютинации на стекле с диагностической ползалентной сывороткой. На дно чашки петри наносят из ампулы каплю сыворотки., в которой тщательно растирают петлей ксследуе«ул культуру. Ь качестве контроля используют ка.лю физиологического раствора ph - 7,2. Содержимое капель смешивают покачивал, ем чашки. Результат учитывают через х-2, окончательно - через 10 мин. мля предотираце-нкя подсыхания капель чашку накрывают крышей, положительной считается реакция на *3-4 креста при отрицательном контроле в физиологическом растворе.

33 зависимости от результата реакции с поливалентной сывороткой серологическое тлияр* :.ан;.о проводят по одному КЗ вариантов.

I, штаммы, агглютинирующиеся указанной сывороткой, исследуют в первую очередь с первым;: тремя г.тошлп группе ним:: с.х-

сямк оывороток, которые агглютинируют бсльзи:нотпо эитеронато-генных вибрионов. Каждую смесь из ампулы разводят физиологическим раствором 1:5, вноолт в пробирки по 0,5 мл и добавляют равный ооъем антигена*

При копользовании составленных смесей оывороток реакцию отавят в одной пробирке, в которую вносят и,5 мл океои и 0,5 мл I млрд, взвеси суточной агаровсй культуры исследуемого штамма. Реакции сопровождают следующими контролями: а) контроль антигена - 0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл взвеси исследуемой культуры;

J) контроль сыворотки - 0,5 мл соответствующей смеси и 0,5 ил физиологического раствора.

После тщательного встряхивал.д все нроопрки помещают на 4 ч в термостат при оУ°, а затем - на 18-50 ч при комнатной температуре.

Учет результатов производит по оодс..ргл!лтой методике, считал положительной реакцию на 5-4 креста. Цра иодученки положительной p2HKiu⁽и с одной из смесей ставят агглютинацию с типовыми сыворотками, вводящими б ее состав, по той ке методике, что •! с готовыми смесями, поле.с .тельная реакция агглютинации с одной и< тпноык сывороток является ос.1свпипек длл отнесения кс-сл*%.усмой культуры пЯГ-ан./ряенов к соответствующему серотипу.

дультурп, не ги глютиап.руюдйсся нервами смесями сывороток, :иучльт со смесл;.:»: 17, У, 71, Ун, составленными из сывороток к ро.;с нитровав.имея серотипам.

a., iUTW/_Mv.u Ь:1...рп«‘нси, которые не агглютинируются иолквалент-поп еннорсткс.;, исследуют со смесями Уш, 1л, а и Яд* содержащими

оыворотки к дополнительным оеротшшм, часть из которых, входящих в УШ смеоь, ооладают выраженными эитероиатогешшми овойст-вами и широко раопространены. При получей..и положительной реакции опиоашшм выше оиооосом определяют принадлежность к соответствующему серотипу.

Из сывороток к вновь оонаруживаемым типовым штаммам могут оыть составлены омеои в дополнение к предлагаемым, а последовательность использования смеоей может сыть изменена в зависимости от состава серотипов iiAT-вибрионов, встречающихся на той или иной территории,

CJaLViA СИРШОГПЧЬСНОИ

Ориентировочная агглютинация о поливалентной агглютинирующей сывороткой О2 - O^q

отрицательна;!

иоъемиая агглютинация со смесями

I    (групповая I) - 2,5,22,40

II    (групповая 5) - 6,26,34,39 Ш (групповая 4) - 16, 24, 37

1У (ооотавленная )- 7,14,15,21,35

У ( ооотавленная)- 17,19,25,32,зб У1 (составленная) - 3,11,20,30,31,

38

УП (групповая 3) - 4,6,12,16 Примечания:

1,    Ь случае получения поделительного результата о поливалентной сывороткой и отрицательного - со смесями 1-У1] рекомендуется ставить реакцию агглютинации со смесями УШ-Л.

2.    для определения серотипа исследуемой культуры ставят реак-

цию агглютинации с типовыми сыворотками той омеси, с которой получен положительный результат,

3,    При положительной агглютинации со смесью I, кроме указанных в схеме серотипов, реакцию агглютинации ставят и с сывороткой против 9-го серотипа, со смесью II - 33-го серотипа, со смесью III - 10-го серотипа, со смесью ЛИ -23-го серотипа.

4,    лультурн отнооят к иетиаирущимся после получения отрицательного результата в реакции ориентировочной агглютинации с поливалентной сывороткой и смеоями УШ-Х1.

XPAiinittiE СиПЗОРОТиК

Сыворотки в амцулах хранят в темном сухом месте при температуре 4°С, а после перенесения в ироеиркя с резиновыми прооками в рефрижераторе при той же температуре. Сыворотки, разведенные физио логическим раствором или соединенные в смеон, можно хранить в условиях холодильника не солее 7-10 дней.