гДЛРСТВБНлАЯ КСШВДВ! ПО Х1ШЧВ2Ж СРЕДСТВАМ ЕОРЬЭД РДОШлвЯ, КиЙЗН^ РАСТЗгГЙ И СОИПКШ ПРИ МСХ СССР
КШЛИЧ^ХКИВ УКАЗАНИЯ ПО OPFS^vl^i;© аКРОКОЗЯЯЕСТВ пксташда [ТАШЯ.КОВШ к БНК|*ЛГлЛ -CP3JU
Часть 7III
ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ
по хими чески и средствам оорьбы с вредителями,
БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИИ И СОРНЯКАМИ ПРИ ЫСХ СССР
Утверждено
Уинистерстиои здривоохраионин СССР 1976 Г.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИИ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЫИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ,КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРьДК
Часть ЛИ
Данные методики апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам оорьбы с вредителями,болезнями растений и сорняками при ЫСХ СССР
Москва - 1977 г
ыечоют фронт растворителя и Помещают в сушильным шкаф при 105° на три минуты. Затем пластинку охлаждают и опрыскивают на пульверизатора хромо г ей ним реагентом, вновь высушивают при тех хе условиях и помещают в эксикатор над парами аммиака на 1 минуту. Зоокумарин проявляется в виде коричневых пятен на желтом фоне с fij -О ,4-0,5 в тонком слое силикагеля и R-J -0,29-0,35 на силуфоле. Количество пестицида в пробе определяют сравнением интенсивности окраски и площади пятна свидетелей tf образца. 3 случае, если задержание зооццда в пробе превышает 10 мкг, то следует получить хроматограмму стандартов большей концентрации (20-100 мкг).
Расчет результатов анализа. Концентрацию эоокуиарина в обрпэце вычисляют по формуле:
где: X-с одержание зооцида в исследуемой пробе, в мг/кг;
А-с оде ржание зоокумарина в исследуемой навеске, в мкг;
P-вес пробы, о граммах*
6.2.2. Газовал хссмцтореЫкя
Полученный после выпаривания остаток растворяют тремя 5дл метилирующего реагента и переносят в пробирку 15 см х 1,5см содержащую 5С0 мг безводного карбонита калия. Пробирку закрывают ватным тампснсм и выдерживают » водяной бане при 65° в течение 15 минут. Затем содержимое перекосят в делительную воронку емкостью 100 мл посредством 30 мл дистиллирован ней воды и б мл гексана. Метиловый эфир эоокумарина экстрагируют путем встряхивания делительной воронки в течение 2 минут, водную фазу отбрасывают, экстракт промывают 15 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и сливают в сухую пре-
/ГУ
бирку. В испаритель газового хроматографа с электрокозах-ватным детектором вводят 6-10 мкл экстрикта при следующих условиях: расход газа-носителя 80 мл/мин, поддув - 120 мл/мин, температура колонки, детектора и испарителя - 225, 260 и 250° соответственно. Чувствительность электрометра - 1x10"**а/шкалу i Запись - 1 см/мин. Время удерживания метилового эфира зоокумарина - 2,6 мин. Высота пика при введении в испаритель 10 нг вещества - Ьи мм. Линейный диапазон от Ь до 26 нг.
Количественное определение проводят на основании калибровочной кривой по высоте пика. График строят в интервале концентраций 5-20 нг зоокумарина. С этой целью в фарфоровые чашки вносят 5, 10 и 2G мкг воокумарина в ацетоне. Ацетон выпаривают, а остаток метилируют, как и пробы. Введение в испаритель хроматографа 6 мкл гексанового экстракту соответствует детектированию б, 10, 20 Hi' зооцнда.
Содержание зоокумарина в анализируемой пробе (в мг/кг) находят по формуле:
где: Ск - количество вещества (щ;), найденное цо калибровочной кривой;
И - объем экстракта (мл), эквивалентный навеске Р (г);
- обьем вводимого в испаритель хроматографа экстракта (мкл).
Настоящая методика позволяет обнаружить микроколичества з'о'ояумарика в мышечной ткани или крови животного, что позволяет диагностировать то.чсикоа.
концентрация зоокумарина в мышечной ткани и крсви животных tflift отравлении колеблется от ) ,С до 10,0 мг/гсг.
/6S
6,3. Спектрофотометрическое определение
6.3.1. Мышечная ткань и крозь животных. Полученный после выпаривания остаток в фарфоровой чашке растворяют в 4 ил 2%-ного раствора гидроокиси натрия, фильтруют через бумажный фильтр в пробирку и измеряют оптическую плотность при 308 ни. В качестве сравнения используют пробу мышечной ткани или крови от того же вида здорового животного,
6.3.2. Препарат пенскумгпин. 0,4 мл фильтрате переносят в колбочку еик. 50 мл и добавляют 9,6 мл 2%-ного раствора гидроокиси натрия. Раствор перемешивают и измеряют его оптическую плотность при длине волн 808 нм в кюветах с длиной светового пути 1 см. В кювету для сравнения наливают 2%-ный раствор гидроокиси натрия.
6.3.3. Приманки (корма). Полученный после выпаривания остаток растворяют в 10 мл 2%-ного р-ра гидроокиси натрия и филтруют через бумажный фильтр в пробирку. 0,2 мл фильтрата смешивают с 9,8 мл 2%-ного р-ра гидроокиси натрия и измеряют оптическую плотность при 308 нм против "холостой" пробы.
Количество вещества измеряют по калибровочном кривой, для построения которой в рдц пробирок емк. 15 мл вносят 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мл стандартного р-ра натриевой соли зоокумарина (0,1 мг/мл),, что соответствует 25, 50, 100 и 200 мкг вооцида. Затем добавляют 2%-ный раствор гидроокиси натрия до объема 10 мл и после перемешивания измеряют опти*-ческую плотность растворов при ЗОЬ им..
Расчет результатов а длиза. Концентрацию зоокумарина в образце вычисляют по формуле!
№
Х« 10“4 •
где: X - концентрация активно действующего в-ва в препарате пелокумарин, мышечной ткани и крови, и кормах, в %\ С - содержание ооокумарина, найденное по калибровочной кривой, мкг;
А - общий объем раствора препарата, мл; а - объем раствора, взятого для анализа, мл;
Р - навеска препарата, в г.
иЬТОДИКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО И СПЕКТРСФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗСОНУМАРИНА В МШЕННОЙ ТКАНИ , КРОВИ ЖИВОТНЫХ, В ПВЕПАРАТЁ ПЕКОКУМАРИН И ПРИМАНКАХ (КОРМАХ) х)
1.Кроткая характернотика :цуепйрита Зоокумарин (М -3-\ оС-ацетс1;к1:бензил)-4-сксикумари») применяют для борьбы с грызунами в животноводческих помещениях в форме пищевых приманок, содержащих 0,025% препарата-.
Это сильнодействующее вещество (1 группа государственной классификации). -ПДюО дл/‘ серы* КРЫС мг/кг, кошек и со
бак ЭО-GG мг/кг. Коэффициент кумуляции 0,4.
Рацемическая dl -форма пестицида представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 159-161°, без запаха. Препарат малолетуч, сохраняет токсические свойства в течение нескольких лет, но растворяется в воде, бензоле; хорошо растворим в ацетоне, хлороформе и диоксане.
2. Принцип метода Хроматографический метод основан на извлечении зоокумарина из биологических объектов хлороформом, очистке экстракта на колонке с окисью алюминия с последующим хроматографическим определением пестицида в закрепленном тонком слое силикагеля по реакции диазосочетания или в виде метилового эфира на газовом хроматографе с электроноэахватным детектором. Чувствительность тонкослойной хроматографии - 2 мкг so о кумарина в
х) Разработана во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии &Л-.Болоховец, В.В.Ермаковым,
Д.Ф.Трахаловым ,утвержден 20 декабря,№50-76,
/Гб
пробе, а при навеске 25 г - С,2 мг/кг. Минимально-детектируемое количество о о оку марина на газовом хроматографе - 1 кг или О ,02 мг/кг. Степень обнаружения зоокумарина - 80-5%.
Спектрофотометричеекий метод основан нс извлечении зооци-да иэ пе но кумарина, кордов, мышсФной ткани и крови животных хлороформом с последующей очисткой экстракта на колонке с окисью алюминии и определением натриевой соли зеокум.арина по характерному поглощению света в ультрафиолетовой области спектра при Х0 нм. Чувствительность метода 10 мкг вещества в исследуемой пробе: 0,4 мл ленокумарика; 0,5 г корма; 25 г мышечной ткани и крови животных. Воспроизводимость 90# - 5%. Процент обнаружения добавок эооцида 90# - 3#.
3. Реактивы, растворы и их приготовление Кислота серная по ГОСТ 4204-66, 1 н раствор; хлороформ по ГОСТ 3160-51; кислота уксусная по ГОСТ 61-69; натрий сернокислый оеэводный по ГОСТ 4166-66; ацетон по ГОСТ 2603-71; аммиак водный по ГОСТ 3760-64;
натрий азотистокислый (нитрит натрия) по ГОСТ 4197-74; 1%-ный водный раствор; гексан;
диэтиловый эфир;
кислота соляная но ГОСТ 3113-67, 0,33 н раствор (готовят из фиксанала);
натрия гидрат окиси (натр едкий) по ГОСТ 4328-66 (2%-ньй раствор);
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;
насыщенный раствор 2,4-дихлоракилииа в С,33 н соляной кислоте. Берут 1 г вё&ества, смешивают со КС мл С#СЗ н соляной кислоты и встряхивают а течение часа, л Ранят раствор в склянке темного стекла в холодильнике* Рейки* в устойчив в течение 3-х мееллеь;
реактив для выявления эсс куЛарина (хромогснньГ реагент): смешивают '2Ь гм 1,.- вс дне го ристнора нитрита -натри»! с 25 мл насыщенного раствора 2,4-Д их лора i лл.чна в 0 „33 ш оо<плк''Ц кислоте. Готовят не реже одного райи и неделю;
смесь растворителей, состоящая .до »пс:ьсзна и ацетона в соотношении 2:1;
основной раствор го с* кумарина, 1 мг/мл: растворяют 100 мг вещества в if0 ни ацетона;
рабочий раствор ио оку мар*/, на, 10 мкт/мп: разбавляют 1 мл основного раствори в LOG мл ацетона;
стандартный раствор 8оокуь.ирнна и нитр.чаьси соли воску-марина для спектроф-стоиег ричсокнх измерений, 0,1 мг /мл: растьорнют 10 мг зооцида в 2/*-нсм раствсре гидроокиси натрия в мерной колбе емкостью 1С0 ил; силикагель КСК; гипс медицинский; окись алкм'лния для хроматографии; кальций хлористый по ГОСТ 4161-67;
калий углекислый (кадия карбонат) но ГОСТ 10&^V'-64, растений порошок, прокаленный в течение 6 часов при температуре 160°. Храня! в эксикато| • над безводным хлористым кальцием;
метилирующий реагент: в колбу емкостью 100 мл вносят 6г безводного карбонита калия, 47,6 мл абсолютно! о. ацетона и 2,6 мл диметилсульфата. После перемешивания реактив хранят
без доступа ?оздух<*;
аце-гсн абсолютный: 0,5 л ицетсна встряхивают ЭО минут с 50 г безводного хлористого кальция. Обработанный ацетон перегоняют на хиг.ямяЬ водяной бане. Первые и последние 50 мл дистиллята отбрасывают, ч остальное'собирают :i склянку с притертой пробкой. Хранят без доступа иочдуха;
натри» хлористый ;ц» JWi 4X33-06, насыщенный водный раствор;
метипсилоксан St -<>0 (5/'), нанесенный на силаниаироминный хроматом о0-100 меш.
Зое реактивы дол*лы бить клал иЬикадии х.ч. или ч.д.а.
4. Прагоюнлепиа силикагеля н пластинок Гранулы силикагеля KCit размалымают в шаровой мельнице, после чего 500 г фракции, просеянной через сито 100 мет, смешивают с 1000 мл соляной кислоты, предварительно разбавленной в два раза водой. Через IX часов надо садочную жидкость декантируют , а осадок промывают три раза дистиллированной водой по 1000 мл до нейтральной реакции. Силикагель высушивают при комнатной температуре и промывают его трижды диэтиловым эфиром (порциями пс 300 мл). После высушивания адсорбент просеивают через сито 100 меш. Для приготовления пластинок 14 г силикагеля и 1 г прокаленного при 1*50° (5 часов) медицинского гипса тщательно растирают в фарфоровой ступке в течение 20 минут до получения однородной массы. Затем порошок переносят в колбу емкостью 250 мл, вносят Лю мл дистиллированной воды и смесь энергично встряхивают 15 минут до удаления пузырьков воздуха. Полученную гомогенную смесь наносят на пластинки по одной чайной ложке, пластинки рысушивают при комнатной тем-
/S9
перстуре в течение сутох.
Для хроматографиювания. можно использовать и пластинки типа* ''’Силуфол".
5. Приборы и посуда
Аналитические весы.
Шутелль-гппарат.
Хроматографические камеры, эксикатор по ГОСТ о371-73.
Спектрофотометр СФ-4& или другой для измерения поглощения в ультрафиолетовой области спектра.
Колбы Срленмейера емкость» 50, 100,250 мл.
Чашк« /и»н Спаривания ЯР 5 и 10.
Мерные цилиндры на 50 и ЮС мл.
Мерные колбы емкость» 100 мл.
Пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл.
Микропипетки на 0,1 мл.
Воронки для фильтрования йР 3 и 5.
Пластинки стеклянные 9 см х 12 см.
Пробирки 15 см х 1,5 см и градуированные - емкостью 15 мл.
Колонки стеклянные для хроматографии: 1,5 см х 35 см.
В качестве колонки можно использовать ьихнюю часть бюретки на 100 ил, разрезав ее наполовину.
Колонка для газовой хроматографии: стекллиния, длиной 0,75 м, диаметром 3 мм.
иикрошприцы емкость» 1C мкл.
Газовый хроматограф Ц6ЕТ-5-68, Jiam-ЬЦД "П" или другой с электроннозахватным детектором.
Ваня водяная.
/СО
Мельница шаровая.
Ступка фарфоровая.
ХОД АНАЛИЗА 6.1. Подготовка проб 6.1f1Т Извлечение ^оорумапина иэ мышечной ткани и кро~ вр животных* 25 г гомогенййированного образца (мышечную ткань, кровь и другой ггатматериал, не подвергшийся гниению) помещают в колбу Зрлонмеивра емкостью 250 мл, куда вносят 10 мл 1 н серной кислоты. Содержимое перемешивают, добавляют 75 мл хлороформа и встряхивают на шутелль-аппарате 40 минут. Затем в колбу вносят через фильтровальную воронку небольшими порциями (во избежании образования комков) 65 г сульфата натрия. Отделившийся хлороформный экстракт фильтруют в колбочку емкостью 100 мл«через тампон стекловаты (или обычной ваты). Извлечение препарата повторяют еще раз с 60 мл хлороформа и образец встряхивают 15 минут. Профильтрованный через ватный тампон экстракт соединяют с первой фракцией.
Объединенные порции экстракта пропускают через колонку, которую готовят следующим образом, В ее нижнюю часть помещают слой ваты (1 см), вносят 10 г окиси алюминия и промывают 20 мл хлороформа; затем вносят экстракт. После того, как весь экатракт опустится до адсорбента, колонку промывают 100 мл чистого хлороформа, а затем 20 мл ацетона (для удаления коэкстрактивных веществ). Зоокумарин.элюируют 50 мл смеси ацетона и 2%-ного раствора гидрата окиси натрия (47:3). Элюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяцой бане.
/6/
Для определения зоокумарина на спектрооютометре уксусную кислоту не добавляют.
6.1.2. Извлечение зоокумарина из препарата пекокумарин.
После 2-х минутного энергичного встряхивания баллона с
препаратом отбирают около 1 г препарата в колбу Эряеимейера емкостью 10и мл. для хроматографического определения на каждые 20 мг пенокумарина добавляют I мл ацетона. Содержимое колбы перемешивают и выдерживаю? СС минут при комнатной температуре. Затем С,4 мл раствора переносят в фарфоровую чашку Ш 5, добавляют С ,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяной бане.
Для определения зоокумарина на спектрофотометре, отбирают около 1 г препарата в колбу Зрленмейера емкостью 100 мл* Пенокумарин растворяют в 2/£-ном растворе гидроокиси натрия из расчета i мл растворителя на 20 мг образца. Содержимое колбы перемешивают и выдерживают на водяной бане при 60° до исчезновения пены. Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр.
6.1.3. Извлечение зоокумарина из кормов (приманок).
0,5 г корма (приманки - в зернах целых или размолотых)
помещают в колбу Эрленмейера емкостью 100 мл, куда вносят 3 ч/ 1 н серной кислоты. Содержимое перемешивают, добавляют 25 мл хлороформа и встряхивают, на шуттель-аг.парате 40 минут. Затем в колбу вносят через фильтровальную воронку небольшими порциями 8-10 г сульфата натрия. Отделившийся хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон в колбочку емкостью 5С мл. Извлечение повторяют еще раз, добавляя 15 мл хлороформа и встряхивая образец в течение 15 минут.
‘Экстракт фильтруют через ватный тампон и полученную
порцию фильтрата соединяют с первой фракцией, а затеи пропускают черев колонку, которую готовят как и при исследовании мышечной ткани или крови. Через колонку пропускают 20 мл хлороформа, (промывают). После того , как весь экстракт опустится до адсорбента, колонку промывают последовательно 50 мл хлороформа и 20 мл ацетона. Зоокумарин элюируют 50 мл смеси ацетона и 2^-ного раствора гидроокиси натрия (47:3). Злюат собирают в фарфоровую чашку № 10, добавляют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и выпаривают досуха на кипящей водяной бане.
При спектрофотометрическом определении эоокумарина уксусную кислоту не добавляют.
6.2. XР0;А4Т0ГРАФИ.ЧШхО£ ШРЕАЫ»£НИЕ SGGJCyЛАРИНА
0.2.1. Тонкослойная хроматография
Полученный после выпаривания остаток растворяют в 0,5 мл ацетона и полностью наносят на пластинку микропипеткой или пипеткой Пастера. Одновременно готовят свидетели, внося в фарфоровую чашку 5-10 мкг вещества, что соответствует 0 ,5 -1,0 мл рабочего раствора зоокумарина. Образцы наносят на пластинки в следующей последовательности: свидетель (5 мкг), образец ( 1 повторность), образец (П повторность), свидетель (10 мкг). Размер пятна не должен превышать 0,5 см. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,5 - 2,0 ем друг от друга и от нижнего и боковых краев пластинки; пятна не должны погружиться в растворитель. В химеру для хроматсграфиро-вания ( эксикатор ) наливают 60 мл смеси гексана и анетона (3:1) и через 2С минут помещают пластинку в вертикальном положении. Камеру, гермитичпо закрывают. Хроматографирование проводят при температуре не ниже 20е. После того как растворитель* поднимется на высоту 6-9 см, пластинку вынимают, от-
/63
