ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

СЫРАВ1НА I ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ

Метад щэнтыф1кацьм генетычна мадыф1каваных крынщ (ГМК) раслшнага паходжання

(ГОСТ Р 52173-2003, ЮТ)

Издание официальное

Г осстандарт Минск

УДК 663/664.001.4:006.354    МКС    65.140;    65.160; 67.060;    КП    03

67.080; 67.100; 67.120;

67.140; 67.140.30;

67.160.20; 67.180.20;

67.200.20; 67.220;

67.230

Ключевые слова: сырье пищевое, продукты пищевые, генетически модифицированные источники, идентификация, метод полимеразной цепной реакции, рекомбинантная ДНК, праймер для промотора, праймер для терминатора

Предисловие

Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации»

1    ПОДГОТОВЛЕН республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ)

ВНЕСЕН отделом стандартизации Госстандарта Республики Беларусь

2    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от 24 июня 2005 г. № 28

3    Настоящий стандарт идентичен государственному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения».

Государственный стандарт Российской Федерации разработан ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность», Государственным учреждением научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), центром «Биоинженерия» РАН.

Официальные экземпляры государственных стандартов Российской Федерации, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт и на который дана ссылка, имеются в БелГИСС.

Степень соответствия - идентичная (ЮТ)

4    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта Республики Беларусь

Издан на русском языке

8.3 Интерпретация результатов

8.3.1    Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.2    Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. или одного из них свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.3    В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.

8.3.4    Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.

8.3.5    Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

9    Контроль результатов идентификации

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM №41 OR SB-0).

10    Требования безопасности

10.1    При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках

10.2    Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточновытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3    При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.

8

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

Приложение А

(обязательное)

Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)

1, 2 - анализируемые пробы; 3 - маркер молекулярной массы 100 п. н.;

4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения; 6-холостой опыт

9

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

Приложение Б

(обязательное)

Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (терминатор nos)

1 - маркер молекулярной массы 100 п. н.; 2, 3 - анализируемые пробы;

4- стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения; 5- стандартный образец состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения; 6-холостой опыт

10

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

Приложение В

(справочное)

Библиография

[1]    ТУ 9642-001-4648062-98 [2]    «Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-4406 [3]    «Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 900-7980 [4]    «Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-86-16 [5]    ТУ 9452-007-18240041-00 [6]    ТУ 9452-001-18240041-99 [7]    ТУ 46-22-603-75 [8]    ТУ 113-04-146-84 [9]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Н 5882 [10]    ТУ 6-09-402-85 [11]    ОСТ 11.029.003-80 [12]    ТУ 6-09-4292-76 [13]    ТУ 6-09-08-1024-81 [14]    ТУ 6-09-13-452-75 [15]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № В 4287 [16]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 1806 [17]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Р 2192 [18]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № А 6877 [19]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Р 1473 [20]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Fluka»), кат. № 53198 [21]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Fluka»), кат. № 44386 [22]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 4788 [23]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 4913 [24]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 5038 [25]    Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Т 9656 [26]    ЗАО «Синтол» Россия (http://www.syntol.ru) [27]    ЗАО «Синтол» Россия (http://www.syntol.ru)

Амплификатор «Терцик МС-2» Камера для электрофореза «Mini-Sub Cell GT Sustem» Источник напряжения «Power Рас 300» Видеосистема «Gel Doc 2000™ Gel Documentation System» Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф «ТЭТА», 12000 мин"1 Термостат «TERMO 24-15» Баня водяная с электрическим или огневым подогревом Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) Гексадецилтриметиламмониум бромид [C|9H42NBr] Спирт изопропиловый [СН3СНОН СН3] Вода деионизированная Трис (оксиметил)аминометан [NH2C(CH2OH)3] 2-меркаптоэтанол [C2H6OS] Этидий бромистый [C2iH20N3Br] Альбумин бычий сывороточный сухой Фермент Taq-полимераза Буфер для ПЦР с MgCI 2 Агароза для электрофореза ПЦР маркер 100 п. н. Стандартный образец состава генетически немо-дифицированного источника пищи растительного происхождения Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0). 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тет-ранатриевая соль, тригидрат (АТФ) 2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тет-ранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) 2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тет-ранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) 2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тет-ранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) Праймеры на промотор 35S; 35S-1 5' GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС 3'; 35S-2' 5' GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3' Праймеры на терминатор NOS: nos-1 5' GAA ТСС TGT TGC CGG ТСТ TG 3'; nos-2 5' ТТА ТСС TAG ТТТ GCG CGC ТА 3' 11

---

Ответственный за выпуск В.Л. Гуревич

Сдано в набор 16.01.2007. Подписано в печать 13.02.2007. Формат бумаги 60x84/8. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Уел. печ. л. 1,86 Уч,-изд. л. 0,84 Тираж экз. Заказ

Издатель и полиграфическое исполнение НП РУП «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) Лицензия № 02330/0133084 от 30.04.2004.

220113, г. Минск, ул. Мележа, 3.

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

Содержание

1    Область применения...........................................................................................................................1

2    Нормативные ссылки...........................................................................................................................1

3    Определения........................................................................................................................................2

4    Аппаратура, материалы и реактивы...................................................................................................2

5    Отбор проб............................................................................................................................................3

6    Подготовка к проведению анализа.....................................................................................................3

7    Проведение анализа............................................................................................................................6

8    Обработка результатов анализа........................................................................................................7

9    Контроль результатов идентификации..............................................................................................8

10 Требования безопасности...................................................................................................................8

Приложение А (обязательное) Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)............................................................................9

Приложение Б (обязательное) Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (терминатор nos)......................................................................10

Приложение В (справочное) Библиография........................................................................................11

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ)

растительного происхождения

СЫРАВ1НА I ПРАДУКТЫ ХАРЧОВЫЯ Метад щентыф1кацьм генетычна мадыф1каваных крынщ (ГМК) расл1ннага паходжання

Raw material and food-stuffs.

Method for the identification of genetically modified organisms (GMO) of plant origin

Дата введения 2006-01-01

1    Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее - продукты) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.

2    Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентилляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

Издание официальное

3    Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1    генетически модифицированные источники пищи: Продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.

3.2    генетически модифицированный организм: Организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генноинженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.

3.3    генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

4    Аппаратура, материалы и реактивы

4.1    Амплификатор типа «Терцик МС-2» под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см³ со скоростью нагрева/охпаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [1].

4.2    Прибор для горизонтального электрофореза типа «Mini-Sub Cell GT System» с комплектом кювет и гребенок [2].

4.3    Источник напряжения типа «Power Рас 300» с диапазоном регулируемого напряжения 50 - 300 В [3].

4.4    Видеосистема типа «Gel Doc 2000™», предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300 - 400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) [4].

4.5    Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.6    Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

4.7    Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 12000 мин"¹) [5].

4.8    Термостат типа «TERMO 24-15» под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 см³, диапазон температур от 15 °С до 120 °С, количество гнезд не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками не более 0,5 °С [6].

4.9    Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость вращения 250 - 3000"¹.

4.10    Печь микроволновая (мощностью не менее 400 Вт).

4.11    Весы лабораторные высокого класса точности (условное обозначение (II) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

4.12    Баня водяная [7].

4.13    pH-метр с набором электродов, с погрешностью ± 0,1 pH.

4.14    Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2 - 2,0 мм³, (шаг 0,01 мм³, точность ± 1,2 %);

0,5 - 10,0 мм³, (шаг 0,01 мм³, точность ± 0,8 %);

2-20 мм³, (шаг 0,01 мм³, точность ± 0,8 %);

20 - 200 мм³, (шаг 0,1 мм³, точность ± 0,6 %);

100 - 1000 мм³, (шаг 1 мм³, точность ± 3 %);

2-10 см³, (шаг 0,1 см³, точность ± 0,5 %).

4.15    Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см³.

4.16    Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 мм³; 10 см³.

4.17    Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 см³ по ГОСТ 12738.

4.18    Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 см³ по ГОСТ 1770.

4.19    Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентрифужной пробирки вместимостью 1,5 см³.

4.20    Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21    Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

4.22    Кислота борная по ГОСТ 9656, х. ч.

2

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

4.23    Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х. ч. [8].

4.24    Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].

4.25    Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

4.26    Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.

4.27    Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х. ч.

4.28    Спирт изопропиловый, х. ч. [10].

4.29    Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.30    Хлороформ по ГОСТ 20015, х. ч.

4.31    Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.32    Вода деионизированная [11 ].

4.33    Трис (оксиметил) аминометан, х. ч. [12].

4.34    2-меркаптоэтанол, х. ч. [13].

4.35    Этидий бромистый, х. ч. [14].

4.36    Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) [15].

4.37    Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 °С - 72 °С [16].

4.38    ПЦР буфер [17].

4.39    Агароза для электрофореза (тип II) [18].

4.40    Маркер молекулярной массы ДНК [19].

4.41    Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0) [20].

4.42    Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5) [21].

4.43    Нуклеотиды:

2'-дезоксиаденозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) [22]; 2'-дезоксицитидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23]; 2'-дезоксигуанозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) [24]; 2'-дезокситимидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) [25];

4.44    Праймеры на промотор 35S [26]:

35S-1 5' GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС 3';

35S-2 5' GAT AGT GGG ATT GTG GGT СА 3'.

4.45    Праймеры на терминатор nos [27]: nos-1 5' GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG 3';

DOS-2 5' TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5    Отбор проб

Отбор проб проводят по стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.

6    Подготовка к проведению анализа

6.1    Приготовление растворов

6.1.1    Приготовление раствора концентрацией с(Трис-НС1) = 1 моль/дм¹

В колбу мерную по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см¹ помещают 12,11 г Трис (оксиметил) амино-метана по 4.33 [12], растворяют в 80 см¹ деионизированной воды по 4.32 [11]. Кислотой соляной концентрированной по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают.

Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.2    Приготовление раствора концентрацией с (NC1) = 5 моль/дм¹

В мерную колбу вместимостью 100 см¹ помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 80 см¹ деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.3    Приготовление раствора концентрацией с (NaOH) = 30 %

В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см³ помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см³ деионизированной воды.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.4    Приготовление раствора концентрацией с (ЭДТА) = 0,5 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23 [8], растворяют в 80 см³ деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят pH раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.5    Приготовление лизирующего буфера

В колбу мерную по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см³ помещают 0,5 г бромида гексадецилтримети-ламмония, растворяют в 10 см³ деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором

2,5 см³ раствора Трис-HCI, приготовленного по 6.1.1, 7 см³ раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8 [6] при температуре 65 °С до полного растворения.

Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34 [13] из расчета 4 мм³ на 1 см³ лизирующего буфера и перемешивают.

6.1.6    Приготовление хлороформа, насыщенного водой

В колбу вместимостью 200 см³ вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см³ хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см³ воды деионизированной по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.7    Приготовление 70 %-ного раствора этилового ректификованного спирта

В колбу вместимостью 200 см³ вносят цилиндром 70 см³ 96 %-ного спирта этилового ректификованного по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см³ деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.8    Приготовление раствора концентрацией с (БСА) = 20 мкг/см³

В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³ помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36 [15], добавляют 1 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм³ приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³, добавляют 1 см³ деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °С - не более 1 мес.

6.1.9    Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией с = 4 ммоль/дм³

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 см³ вносят 96 мм³ деионизированной воды, 1 мм³ АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [22], 1мм³ ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [24], 1 мм³ ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43 [23], 1 мм³ ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43 [25], смесь перемешивают.

Срок хранения при температуре минус 20 °С - не более 12 мес.

6.1.10    Приготовление 1 ■ ТВЕ буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г кислоты борной по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.1.11    Приготовление раствора концентрацией с (C₂iH₂oN₃Br) = 10 мг/см³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 г бромистого этидия по 4.35 [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 12 мес.

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

6.1.12 Приготовление 2 %-ного агарозного геля

6.1.12.1    В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 см³ помещают 1 г агарозы по 4.39 [18], добавляют 50 см³ буфера 1 • ТВЕ, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °С и кипятят до полного расплавления агарозы.

6.1.12.2    Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °С, автоматическим микродозатором добавляют 5 мм³ раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.

6.1.12.3    Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15-30 мин после остывания геля гребенку удаляют.

Допускается хранение геля в 1 ■ ТВЕ буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °С до 5 °С не более 7 сут.

6.2 Подготовка пробы

6.2.1    Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0) no 4.41 [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5) no 4.42 [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм³ лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм³ лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа «Вортекс».

6.2.2    Приготовленные по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют при температуре 65 °С 40 - 60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания и центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф по 4.7 [5] при частоте вращения 12000 -13000 мин"¹.

6.2.3    Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, не захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм³ хлороформа, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин'¹ при комнатной температуре.

6.2.4    Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.

6.2.5    Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, добавляют в каждую из них по 600 мм³ изопропилового спирта по 4.28 [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.

Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °С не менее чем на 30 мин для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °С.

6.2.6    Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения 12000 мин'¹ при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2-3 раза промывают 200 мм³ 70 %-ного этилового ректификованного спирта, приготовленного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15 - 20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин"¹. Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

6.2.7    Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50 - 100 мм³ деионизированной воды и получают раствор ДНК.

Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °С сроком до одного года в морозильной камере.

5

6.3 Приготовление реакционных смесей № 1 и № 2

6.3.1    Приготовление реакционной смеси № 1 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³, помещенную в кювету со льдом, вносят

312.5    мм³ деионизированной воды, 52,5 мм³ 10 буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38 [17], 26 мм³ смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм³ праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.44 [26], 13 мм³ праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.44 [26], 2,5 мм³ фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм³) по 4.37 [16], 52,5 мм³ раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.2    Приготовление реакционной смеси № 2 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³, помещенную в кювету со льдом, вносят

312.5    мм³ деионизированной воды, 52,5 мм³ 10 буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 мм³ смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм³ праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.45 [27], 13 мм³ праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.45 [27], 2,5 мм³ фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм³), 52,5 мм³ раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.3    Реакционные смеси № 1 и № 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин"¹. Реакционную смесь № 1 разливают по 90 мм³ в пять микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см³ (или 0,5 см³ в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционную смесь № 2 разливают по 90 мм³ в пять других микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см³ (или 0,5 см³ в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси № 1 и № 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

7 Проведение анализа

7.1    В первые две пробирки с реакционной смесью № 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1 -6.2.7, по 2 мм³ в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью № 1 и в третью пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0), no 2 мм³ в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью № 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), no 2 мм³ в каждую.

В пятую пробирку с реакционной смесью № 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью № 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм³ в каждую - холостой опыт.

7.2    В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле 20 - 40 мм³ вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3    Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.

6

СТБ ГОСТ Р 52173-2005

Таблица 1 - Условия амплификации для 35S промотора

Стадия Тип амплификатора Crocodile II Gene Amp 2400 Progene Trio Терцик МС-2 Денатурация 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/96 °С 3 мин/94 °С Амплификация 8 с/95 °С 30 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С 36 с/95 °С 72 с/54 °С 84 с/72 °С 30 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С Количество циклов 40 40 40 40 40 Конечное удлинение 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С Фаза остывания 1 мин/30 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С Скорость нагрева 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5°С/с 1 °С/с 0,77 °С/с Скорость остывания 1 °С/с 3,15°С/с 1,5°С/с 1 °С/с 3,15°С/с

Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos

Стадия Тип амплификатора Crokodile II Gene Amp 2400 Progene Trio Терцик МС-2 Денатурация 3 мин/95 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С Амплификация 20 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С 36 с/95 °С 72 с/54 °С 84 с/72 °С 30 с/95 °С 40 с/54 °С 40 с/72 °С 20 с/94 °С 40 с/54 °С 60 с/72 °С Количество циклов 40 40 40 40 40 Конечное удлинение 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С Фаза остывания 1 мин/30 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С Скорость нагрева 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5°С/с 1 °С/с 0,77 °С/с Скорость остывания 1 °С/с 3,15°С/с 1,5°С/с 1 °С/с 3,15°С/с

7.4    По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм⁵ смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5    В отдельный карман геля вносят 8 мм³ маркера молекулярной массы ДНК по 4.40 [19].

7.6    Гель помещают в камеру прибора по 4.2 [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1-ТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7    Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8    Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.

8 Обработка результатов анализа

8.1    В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), содержащего промотор 35S] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п. н.). В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0)], и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п. н.).

8.2    В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-5), содержащего терминатор nos] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п. н. В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM № 41 OR SB-0)], и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п. н.

7

1