МИНИСТЕРСТВО НЕФТЯНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
вниисптНЕФТЬ
ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ
ОТНОСИТЕЛЬНО АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ
РД 39-0147103-350-89
г.Уфа
Министерство нефтяной промышленности ВНИЙСПТнефть
УТВЕРШН
начальником Главного научно-технического управления Довжком Е.М.
9 марта Х989г,
РУКОЮДЯЩЙ ДОКУМЕНТ
ОШКА БАКТЕРИЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ ОТНОСИШЬНО АДГЕЗИРОВАНШХ КЛЕТОК СУДМАТ'ЮССТАНАВЛИВАЩЩ БАКТЕРИЙ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ
РД 39-0147103-350-89
10
Затем для диспергирования биоплекхк флакон энергично встряхивают в течение (30-60)с или подвергают ультразвуковой обработке ка диспергаторе (22 кГц, 0,3-0,4 А, 30-60 с). При этом клетки СВБ сохраняют сэою жизнеспособность. Из приготовленной суспензии делают 7-9 разведений. Пробы инкубируют з течение 14 дней при теьзхературе 32-35 °С.
5. ОЦЕгПСА ВАКТЕР;ИДШЮТС ДсЙСТЕМ РЕАГЕНТОВ
5.1. В ряд маркированных стерильных пробирок известного объема (20-25 см®) вводят определенное количество исследуемого реагента (например, 100,200...500 мг/дм3 и т.п,) и наливают предварительно прокипяченную и охлажденную минерализованную воду.
Состав соответствует сточкой воде месторождения, где предполагается дальнейшее испытание реагента.
5.2. Образцы со сформировавшейся ка них окопденкой достают из сосуда стерильные пинцетом к промывают их стерильным буферным раствором (pH = 7,0-7,2) 3-4 раза для удаления культуральной среди и планктонных хлеток СЕВ.
Для сохранения асептических условий эту и последующие операция рекомендуется выполнять в камере с ламинарным течением воздуха кли ь струе инертного (стерильного) газа, например, гелия.
5.3. Образцы с адгазированными хлоткамк СВЗ помещают в пробирки с бактерицидом и закрывают пробирка: пробкой. Пробы выдерживают при комнатной температуре от I до 24 часов. Для выбора более оптимальных параметров технологического режима время выдержки
я концентрации исследуемого бактерицида варьируют,
5.4. Затем обработанные бактерицидом образны с адгесирован-ькык клетками помещают в пробирки с питательной средой Постгейта и инкубируют в термостате а течение 14 суток при температуре 32-35 °С. j'se пробирки с образцами без добавления реагента служат контрольной пробой.
II
Дня каждой концентрации проводят три параллельных испытания* 5*5. Наблюдение за образцами осуществляют визуально , отмечая развитие СВБ во образовашш черного осадка сульфида железа, рао-проотранящвгооя от образца вверх по объему питательной среды* Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности действия бактерицида.
5*6. С целью определения эффективности действия бактерицидов на адг в зареванные клетки бактерий можно рекомендовать количественное выявление жизнеспособных СВБ в биопленке методом предельных разведений* Для этого адгезированные клетки СВБ после воздействия на них бактерицида удаляют о поверхности образцов (п*4.5)е готовят суспензию клеток и делают ряд разведений* Затем пенищлликоше флаконы с пробами помещают в термостат при температуре 33 °С и наблюдают за развитием бактерий по образованию осадка сульфида железа* Отсутствие роста СВБ свидетельствует об эффективности действия бактерицида*
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
1. Общие положения 3
2.Оборудование и материалы 4
3, Подготовка и стерилизация питательных
сред,добавок и посуды 7
4. Культивирование адгезированнкх сульфатвос-
станавливаюших бактерий 9
5.Оценка бактерицидного действия реагентов Ю
РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ
ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИДНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕАГЕНТОВ ОТНОСИТЕЛЬНО АДГЕЗИРОВАНШХ КЛЕТОК СУЛ1ФАТ-ВОССТАНАВЛИВАДЦИХ БАКТЕРИЙ ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЯХ
РД 39-0147103-050-89
450055, г.Уфа,прооп.Октября,144/3
Подписано к печати 12.04.89г.
Формат 60x90/16. 0,6 уч.-иэд.л. Тарах 136 аха. Закда J» //<f Ротапринт ШИИСПТнефти
Руковсудашй документ "Оценка бактерицидной эффективности реагентов относительно адгезированных клеток сульфатвосстанав-диващнх бактерий при лабораторных испытаниях" разработан ВНИИ-СИГнефть при участии ОЕЦ Башкирского научного центра УрО АН СССР. Исполнители:
от ВНИИСПТнефть - с.н.с.Мурзагильдин З.Г. # м.н.с.Юднна Е.Х\» м.н<о,Сабирова АД.;
от ОЕЦ Баятирокого научного донтра УрО АН СССР - ведлшучн, сотрДмагушш М.С.
рукоюдда ДОКУМЕНТ
Оценка бактерицидной эффективности реагентов относительно адгезированных клеток сульфатвосстанавлившдих бактерий при лабораторных испытаниях
РД 39-0147103-350-89
Вводится впервые
Срок введения установлен с I кая 1989г.
Настоящий руководящий документ предназначен для инженерно-технических и научных работников предприятий (организаций) Миннефтепрома, занимающихся проблемами защиты нефтепромыслового оборудования и коммуникаций от микробиологической коррозии.
I. ОБЩИЕ ШШОЕЕНИЯ
I.I. Значительная часть коррозионных повреждений нефтепромыслового оборудования и коммуникаций обусловлена жизнедеятельностью микробных сообществ, формирующихся в условиях нефтяного месторождения. Среди микроорганизмов, инициирушкх процесс разрушения металла, главная роль принадлежит сульфат в о с ст акав л и в агощим бактериям (СВБ).При этом большая часть СВБ, содержащаяся в нефтепромысловых водах, адгезирована на твердой поверхности и лишь небольшое количество представлено свободно-плавающими (планктонными) клетками* Адгезия бактериальных клеток на поверхности осуществляется с помощью гфодуцкруемых ими внеклеточных биополимеров - полисахаридов, которые играют роль барьера, предохраняющего клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды,
В том числе и бактерицидов. Бактерициды оказывают избирательное действие на клетки бактерий. Как правило, адгезироваиные СВБ б о-
4
лее устойчивы к их действию, чем планктонные клетки*
Следовательно, для оценки реальной эффективности бактерицидов необходимы исследования как на планктонных, так и на адгези-рованных клетках СВБ.
1.2. Данная методика разработана для скрининга реагентов относительно адгезированных на металлической поверхности СВБ в лабораторных условиях.
1.3. Сущность метода заключается в следующем: образцы из малоуглеродистой стали выдерживают в активной культуре СВБ.
Затем их обрабатывают бактерицидом и асептически переносят в культуральные сосуды с питательной средой и определяют минимальную летальную концентрацию реагента. Испытания проводятся в статических условиях.
2. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
|
автоклав электрический |
- по ГОСТ 9586-75Е |
|
термостат суховоздушный |
|
|
ТС-80М-2 |
- по ТУ 64-I-1382-83 |
|
шкаф сушильный лаборатор |
|
|
ный |
- по ТУ 16-531.097-67 |
|
диспергатор ультразвуковой |
- по ТУ 25-05.2170-77 |
|
приспособление для закру |
|
|
чивания алюминиевых кол |
|
|
пачков |
- |
2Л. Для работы с адгезированными на металлической поверхности сульфатвосстанавливающими бактериями необходимо следующее оборудование:
шприцы медицинские, емкостью 1,2 мл, с набором инъекцион
ных игл
5
пипетки
колбы плоскодонные склянки пенициллиновые с плос« кими резиновыми пробками пробирки химические стерилизатор медицинский пробки резиновые спиртовки
спирт этиловый ректификованный технический рН-метр-милливольтметр типа рН-673М
бумага индикаторная универсальная
алюминиевые колпачки образцы плоские диаметром 10 мм (h « 2 мм) из малоуглеродистой стали 3 камера с ламинарным течением воздуха типа УО-ЕГ или УЕБК-1 - ТУ 46-22-562-80 2.2. Для обнаружения СВБ и поддержания культуры с целью сохранения жизнеспособности клеток» а также таксономических свойств бактерий используется среда Постгейта В: основная среда калий фосфорнокислый
однозамещеннкй КНуР04-0*5 г - по ГОСТ 4198-75 аммоний хлористый - I г - по ГОСТ 3773-72
кальций сернокислый - 1,0 г
магний сернокислый 7-водный
MyS04.TH20 - 2,0 г
натрий молочнокислый C^igO^/Za -
3,5 г
натрий хлористый /S аС£ - 5 г Добавки:
дрожжевой экстракт(5% водный экстракт)- I г
железо сернокислое з&кисное
7-водное ^ei'O^.TH^O - 0,5 г - по ГОСТ 4148-78
натрий углекислый кислый /ГаНСОд - по ГОСТ 4201-79 натрий сернистый J’agi .9Н20 - 0,2 г - по ГОСТ 2053-77
В качестве восстановителей для питательных сред можно использовать сульфид натрия, аскорбиновую кислоту и другие.
Все реактивы основной среды растворяют в I л водопроводной воды. Добавки готовят каждую в отдельности.
2.3. Для накопления клеток GBB в лабораторной практике дня исследовательских целей используется среда Постгейта С! калий фосфорнокислый однозаме-
щенный KHgPO^ - 0,5 г - по ГОСТ 4198-75
аммоний хлористый //Й4СГОСТ 3773-72 натрий сернокислый Л/а2^04 - 4,5 г - по ГОСТ 6053-77 кальций хлористый 6-водный
СаС£ 2-бН2° “ °»06 г - по ГОСТ 4209-77
магний сернокислый 7-водкый
f
натрий молочнокислый CgHgOg/Ka - б г -натрий лимоннокислый CgHgO^/Za -0,3 г
дрожжевой экстракт - 0,1 г
7
железо сернокислое - 7-водное ^04*7^0 - 0,004 г
дистиллированная вода - I л
хлористый натрий N&C-t -по мере надобности
3. ПОДГОТОВКА И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ДОБАВОК И ПОСУДЫ
3.1. Приготовление добавок
Навеску дрожжевого экстракта, растворенную в дистиллированной воде, тщательно перемешивают, кипятят 20 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вновь кипятят 20 мин и фильтруют через мелкопористый бумажный фильтр.
Железо сернокислое закисное готовят в виде 5 % раствора в 2 % растворе соляной кислоты.
Натрий углекислый кислый - 5 % водный раствор, который используют для установления pH среды до 7,2.
Натрий сернистый - 5 % раствор в 5 % растворе натрия углекислого кислого, хранится в холодильнике, после стерилизации используется не более 7 дней.
3.2. Стерилизацию питательных сред, добавок и других материалов проводят насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного в специально предназначенных для этого автоклавах.
Питательную среду и добавки разливают в колбы не выше чем на половину объема колбы и закрывают ватными пробками и бумажными колпачками. Стерилизацию основной среди проводят в автоклаве-при температуре 120± 2 °С, избыточном давлении ОД МПа, а добавок г при давлении 0,05 МПа. Время стерилизации 30 мин.
3.3. После стерилизации основной раствор питательной ореды обескисдоооживают кипячением о последующим быстрым охлаждением под
8
струей водопроводной воды. Затем в той же последовательности, которая указана в п.2.2., вносятся добавки.
3.4. Величину pH среды контролируют с помощью pH-метра или по универсальной индикаторной бумаге. Раствор сульфида натрия приливают по каплям стерильной пипеткой до появления темно-серой окраски среды. Разлив сред и добавок проводят с соблюдением правил стерильности над пламенем спиртовки.
3.5. Установка автоклава и работа с ним производится при строгом выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.
Цростерилиэованнке автоклавированием среды проверяют ка стерильность путем термостатиров алия в течение суток при температуре 30 °С. Если среда сохраняет прозрачность, считают, что она стерильна.
Хранят среда в холодильнике. Срок хранения не более 2-х недель.
3.6. Всю посуду перед стерилизацией тщательно моют и высушивают .
3.7. Колбы, пробирки и пенициллиновые склянки закрывают ватными пробками и заворачивают в бумагу.
3.8. Пробки готовят из медицинской ваты, обертывают слоем, марли и завязывают ниткой на свободном конце.
3.9. В концы пипеток вставляют ватные тампоны и заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см.
ЗЛО, Резиновые пробки моют горячей водой с добавлением соды, затем тщательно промывают водопроводной к дастиллировакной водой, помещают в термостойкие стаканы с водой и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и избыточном давлении ОД МПа.
З.П. Подготовленную посуду стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при 160 °С r течение 2 часов с момента достижения
9
указанной температуры*
3.12. Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после ого охлаждения ниже 60 °С.
4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЩЕЗШВШШ СУЛЬФАТВ0ССТАг1Ш1ИВА]ШЩ БАКТЕРИЙ
4.1. Металлические образны тщательно обезжиривают, промывают водой, опускают ка 5 мин в раствор соляной кислоты 1:1, снова промывают водой и затем обрабатывают 70 % раствором этанола.
4.2. Подготовленные образцы помещают на дно стерильного сосуда, вносят питательную среду Постгейта и накопительную культуру СВБ (2-3 суточную) в количестве 5-10 % от объема среды, закрывают пробкой и помещают в термостат (температура 32-35 °С).
4-3~ Период инкубации длится 5-7 дней до достижения статических условий роста адгезкрованных СВБ. Рост СВБ определяется количественно во время всего периода инкубации.
4.4. Количественная оценка адгезкрованных СВБ производится методом предельных разведений после предварительного удаления клеток с поверхности металлических образцов. Результаты представляются как количество клеток на единицу площади - кл/см2.
4.5. Удаление, адгезкрованных клеток (биопленки) о поверхности образцов осуществляется следующим образом:
образец помещают в стерильную чашку Петри и, придерживая пинцетом, очищают его поверхность небольшими кусочками (~1 см2) стерильной губки типа "Эффект”, загрязненные кусочки губки помещают во флакон со средой Постгейта; или образец помещают в стерильную чашку Петри (или фарфоровую чашку) с питательной средой и, придерживая его пинцетом, делают ооскоб стерильным скальпелем. Полученный ооскоб переносят в пенициллиновый флакон.
