ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ ПО ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ БОРЬБЫ С ВРЕДИТЕЛЯМИ, БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИИ И СОРНЯКАМИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Часть 17-я

Данные методики апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками

Москва

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ ПО ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ БОРЬШ С ЬРЬЦЦ1ТШШ_>Б0ДЕ31Ш1 РАСТЕНИЙ И СОРНЯКАМИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИИ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ДОГМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Чаотъ 17-я

Данные методики апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомнссии по химическим средствам борьбы с вредителями,боле8нями растений и сорняками

Москва -

Хлорорганнческие пестициды

7.    Временные методические указания по определению блазера в воде, почве, сое и зеленых листьях методом хроматографии в тонкой слое

27 ноября 1984 Г* №3156-84

8.    Временные методические указания по определению

дилора в меде методом тонкослойной хроматографа    22    мая 1985 г. №3884-85

9.    Временные методические указания по хроматографическому определению Щ в воде

22 мая 1985 г. №3876-85

10.    Временные методические указания по определению

модауна в воде и почве газохидкостной хроматографией    21    ноября 1985 Г. №4030-85

11.    Методические указания по определению тиолана и продуктов его превращения в воде хроматографическими методами _{а ноября 1Э6}5 г. №4035-85

12.    Временные методические указания по определению триалдата методом газожидкостной хроматографии в воде, почве и зерне пшеницы

21 ноября 1985 г. №4032-85

13.    Временные методические указания по определению мэтодами ПОС н ТСХ аналога ювенильного гормона п-хлорфенилового вФвпа гераниола в Берне пшеницы, почве,воде в зеленых листьях

12 апреля 1985 г. №3254-85

14.    Временные методическиеиу указания по определению остаточных количеств фозилада в свекле методом газожидкостной хроматографии

22 мая 1965 г. £3675-85

15.    ременные методические указания по определению регулятора роста растений ЭБ£-5 в воде, растительном материале методом ТСХ

21 ноября 1985 г. £4031-65

16.    Методические указания по определению остаточных количеств хлорорганлческлх пестицидов и продуктов их разложения (./«-изомера ПИТ. V-изомера ГХИГ. гептахлора, альдрина. кельтана. ДДЭ. ЛЛД. ЛИТ)

в воде хроматографическими методами при совместном присутствия j _{1986 Гв} Ш20-86

Азотсодержащие пестициды

17.    Временные методические указания по определению ацетала в воде, почве, картофеле, верне и зеленой массе кукурузы и сои методами ГаХ и ТСХ

21 ноября 1985 г. £4029-85

18.    Методические указать по определению диФенамяда в в воде методом тонкослойной хроматографии

21 ноября 1985 г. £4033-85

19.    Методические указания по определению карахола и его метаболита бензоклпродкислоты в почве методом газожидкостной хроматографии

31 июля 1984 г. £3072-84

20. Временные методические указания по определению лентаграна в растительной продукции, почве и воде ТСХ

12.04.85 г. №3253-85

21.    Методические указания по определению монуро-на и дкуроиа в чае методом газожидкостной хроматография ₃ 1Шваря Is85 г> >Ш87-85

22.    Временные методические укаэания по определению набу в воде, почве, капусте, сое и зеленых листьях методом хроматографа в тонком слое _{22 мая 19й5 г>} *3860-85

23.    Временные методические указания по определению раукдапа в воде методом ТСХ (дополнение к №2434-81)

21 ноября 1985 Г. №4034-85

24.    Временные методические указания по определению сонаяена в воде, почве и зеленой массе сои хроматографическими методами

3 января 1985 г. №3200-85

25.    Временные методические укаэания по определению соналена в маслах подсолнечника, репса

и клещевины ISX 22 мая 1985 Г. №3894-85

26. Временные методические указания по определению стомпа методом ПК в табаке

12 апреля 1985 Г. №3252-85

27. Методические укаэания по определению тклта в растениях,почве, воде методом гозоаидкост-

ной хроматографии

3 января 1985 г, $ 3190-86

28.    Методические указания по определению триадимо-фона ( байлотона) методом ТСХ в воде

22 мая 1986 г. *• 3692-85

29.    Методические указания по определению фонмедл»{Улмп_| и

десмедифама в воде природных водоемов ТСХ

21 ноября I^Qdt> г. > 4036-83

Прочие пестициды

30.    бременимо методические указания по определению остаточных количеств арилона по бемзолсульфонамяду в зернах хлопка,почве и воде тонкослойной хроматографией

21 ноября 196эг. '* 4037-85

31.    Методические указания по определению гидразида малеиновой кислоты в табаке колориыеярическиы методом

12 апреля I9j5r. $3251-35

32. Методические указания по определению диметилсуль-Фоксида и его метаболита диметнлсульФона методом гаэожидкястной хроматографии в сахарной свекле, картофеле и зеленой массе

28 мая 1986 г. $ 4119-86

33. Временные методические указания по определению

остаточных количеств препарата 320-К в зерне и

воде тонкослойной хроматографией

22 мая 1985 г. $ 3390-85

34. Временные методические указания по определению ДРХ-4189 С ГЛИИ) в воде, почве, растительном материале методом газожидкостной хроматографии 22 мая 1985г. $ 3885-85

ш.

СТ£о

Методические указания по определению пестицидов в воздухе 35о Временные методические указания по газохроматографическому измерению концентраций ацетала и его продукта 11-хлормот11Л-2-метзд-6-э?Ш1%яорацетащц1Ида в воздухе рабочей воны

21 ноября 1885 г» JM027-85    230

36о Временные методические указания по газохроыатогра-фи чес к ому измерению концентраций препаративной формы АХ1Г-вОА-в4 в воздухе рабочей воны

21 ноября 1985 Го £4025-85    235

37 о Временные методические указания по газохроматографическому измерению концентраций смеси горадидгекса-ноата и геранилоктаноата в воздухе рабочей воны

21 ноября 1985 Го £4024-85    239

38о Временные методическое указания по газохроматогра-фичеокоцу измерению концзнтрашш гараншшзовалерзата в воздухе рабочей зоны

21 ноября 1985 Го JS4026-85    243

39о Методичеокпе указания по газохроиатографаческоыу измерению концентраций 2.4-Д в воздухе рабочей войн

I июля 1986 Го £4122-86    247

40о Временные иетодичеокие указания по определению

лантала в воздухе рабочей зоны газохроштографячес-ннм методом    22 мая 1985 Го Ш882-85    254

41 о Ывтодическяа указания по хроматографзческоцу измерению коЕпевтращш дицетидсулыхата в воздав рабочей воны

42.    Временные методические указания по хроматографическому измерению концентраций дозанекса. 5-хлоэ-4 метоксианилида, 3-хпор~4-метокскнктробензола в воздухе рабочей зоны

21 ноября 1965 г. £4017-65

43.    Временные методические указания по хроматографическому измерению концентраций квина в воздухе

X июля 1986 Г. )М127-86

44.    Методические указания по газохроматографичоскому измерению концентраций леишдила в воздухе рабочей

^зокы    I    июля 1986 г. £4125-86

45.    Методические указания по хроматографическому измерению концентраций линугона в воздухе рабочей

^зоны    21    ноября 1985 г. £4020-85

46.    Временные методические указания по хроматографическому и газохроматографяческоыу измерению концентраций донтоеда в воздухе рабочей воны

21 ноября 1985 г. M0I6-85

47.    Временные методические указания по хроматографическому намерению концентраций иетоксихлора„ анизола и хлораля в воздухе рабочей зоны

21    ноября 1985 Г. £4022-85

48.    Временные методические указания по фотонетричео-коиу в хроматографическому измерешш концентраций шакала в воздухе рабочей гоны

22    мая 1985 Г» Й3881-85

Настоящие методпческие указания предназначены для санитарно-эпидемиологических с таили Я и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома . СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве гфшиальнкх Группой экспертов при Госкомиссяи по химическим ерсдствам борьбы с вредителей,болезнями растений и сорняками Гпоагропрома СССР

Методические указания согласовали и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИОДяТО им.Марпиновского В.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

РЩКШОНШ КОЛЛЕГИЯ

Л.Г.Александрова, Д.Б.Гйрешх, А.А.Калинина (за;4.председателя), Ц.А.Клисенко (председзтеть), Г.И.Короткова, М.В.Письменноя, Г.А.Хохолькога, В.Е.Кривейчук.

- 355 -

•утвервдаю"

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР

Л.И.ЗАЙЧЕНКО

"22" мая 1985 г.

* 3891-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ ИМ РАСТЕНИЯХ ИМЦУННОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

1.    Характеристика анализируемого инсектицида.

Лепидоцид - бактериальный инсектицидный препарат для борьбы с листогрызущими насекомыми. Действующи*началом препарата служат споры и продукты жизнедеятельности бактерий    tins    -

£л~смл 1Л s (х* rcsss^ tusct* ■

Лепидоцид практически не токсичен для теплокровных животных: при введении в желудок ЛДзд для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс равна 9,7+1,9 г/кг. Споры ** Оплы^**-*** isasr tc»Asui tasc^ ^в организме теплокровных не прорастают и не вызывают инфекционного заболевания.

Концентрированные суспензии (Т-5516) лепидоцида оказывают слабое кожно-раздражающее и кожно-сенсибилизирущее действие.

В рабочих концентрациях (0, Кб) суспензия лепидоцида раздражающим действием не обладает.

Препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета, имеющий слабый специфический запах. В воде обрадует не стойкую суспензию.

2.    Методика определения лепидоцида иммуннофлюоресцентным методом

2.1.I. Принцип метода

В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положена реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с мечеными флюоресцеином антителами и выявления спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммуннофлюоресцентный метод.

- J56 -

2.".2. Метрологическая характеристика

Предел обнаружения: одна спора в 50 полях зрения, что соответствует (при титре лепидоцида ^T0^J; спор/г) - О,ОТ мкг препарата на . г пробы или ТО³ спор на У г пробы. Среднее значение определения спор Ь3,б£ при пяти исследованных паралельных пробах, среднее квадратическое отклонение бДоверительный интервал среднего при Р * 0,95 соответствует + 77,4^.

2.1.3. Избирательность метода

Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведении !:!60-?:640 и выше.

2.2.    Реактивы и материалы

Этанол, 96?,ТУ 6-09-171С-77 ; Физиологический раствор (0,8&£ раствор хлористого натрия); мертиолат; неФлооресцирующее иммерсионное масло; сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалея, г.Москва; специфическая имммунная сыворотка кроликов против спор Ллг. ,t уч Г*. ДО Г(\л к^м'тЛ-i а**. .

2.3.    Приборы, аппаратура, посуда

Люминесцентный микроскоп марки МБИ-75 У или другой аналогичный названному; объект-микрометр; центрифуга до 12 тыс. об/мин.; термостат на 37°С; шутель-алпарат; колбы; пробирки бактериологические ; чаши Петри; предметные стекла; микропипетки.

2.4. Подготовка к анализу

2.4.1. Приготовление специфических иммунных сывороток против спор /За r/W« i /Л/*-* f /«-cV «/«4-М

Для получения специфической иммунной сыворотки проводят иммунизацию кроликов однократной инъекцией в область подколенного лимфатического узла суспензии спор чистой, культуры /Л,1'Лт.    ,    прогретой    в    течение    одного часа

на кипящей водяной бане, в дозе 10^ микробных клеток на животное. Через месяц кроликов реиммунизируот второй однократной инъекцией антигена из спор в область подколенного лимфатического узла в той же дозе. Спустя месяц после реиммунизации проверяют титр сыворотки в непрямой реакции иммунноФшооресценции. При титре не менее Т:TG0 получают сыворотку в нужном количестве'¹используют для проведения анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении •7:70000 или подвергат* лиоФмльночу высушиванию.

- 357 -

2.4.2. Определение титра специфической иммунной сыворотки

Из чистой культуры или из товарной Формы препарата готовят взвесь спор в физиологическом растворе в концентрации 10^ спор/мл (из препарата готовят суспензию в разведении Т11000).

На сухие обезжиренные предметные стекла наносят по калле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю.

После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 минут, обрабатывают иммунной сывороткой в разведении 1:10,

1:20, Т:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения спор.

Для контроля иммунологической специфичности готовят контрольные препараты:

а)    обработанные только фиыорсицируыфй ослиной сывороткой против глобулинов кролика;

б)    обработанные физиологическим раствором вместо иммунной сыворотки;

в)    обработанные нормальной кроличьей сывороткой вместо иммунной.

За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, "полыхающее" зеленое свечение спор. В контрольных мазках свечения спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки , имеющие титр не менее Т:Т60. Рабочим разведением служит разведения равные 1/2 титра, т.е. 1:80.

2.5.    Отбор проб

Пробы для анализа отбирают согласно унифицированным правилам отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденным Зам, Главного государственного санитарного врача СССР 21.08. 1979 за * 2051-79.

Дроби отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте (не выше +5°С) и анализируют не позднее, чем через 5-7 дней.

2.6.    Проведение анализов

Для анализа Т г листьев измельчают с соблюдением правил стерильности, добавляют 15-20 мл стерильного физиологического раствора и встряхивают в колб? на шутель-аппарате в течение 20 минут. Смыв фильтруют через два слоя стерильной марли и ваты и центрифугируют при 12 тыс. об/мин. в течение 20 минут. Надосадочную

- Э5Р -

жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 0,1 мл (Физиологического раствора. На предметные стекла наносят 0,01 мл суспензии и равномерно распределяет ее на площади Т мм . Препараты высушивают на воздухе и Фиксируют этанолом 30 минут. Затем наносят иммунную СЫВОРОТКУ ПРОТИВ    tUa<4t    10съ    <-<*лi to**'

в рабочем разведении и помещают во влажную камеру при температуре 37°С на 20 минут. Влажную камеру создают путем помещения в чашку Петри Ультра, смоченного (физиологическим раствором.

По истечении времени инкубации препараты промывают Т-2 минуты проточной водой, высушивают на воздухе, затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 минут во влажной камере при 37°С. Далее препараты промывают проточной водой 1-2 минуты высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 х 1,25 и окуляр 4 х.

Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидо-цида Т:J000 на (физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанном участке, которые обрабатывают по той же схеме.

Для анализа проб плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного (Физиологического раствора, достаточным для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда Ьей?°и?уги^ау5Р^ель"^ага,аР^{ате в} течение 20 минут. Смыв (фильтруют, сливйот нЖГсадочную жидкость, осадок ресуспендируют в 0,1 мл (физиологического раствора, готовят препараты на предметных стеклах и обрабатывают их сыворотками, как указано выше.

2,7. Расчет

С помощью объект-микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении.При использовании объектива 90 х 1,25 и окуляра 4 х она равна 0,02 мм^.

На каждом мазке под иммерсией рассматривают 5С полей зрения, в которых подсчитывают все споры имеющие яркое "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения.

Расчет концентрации спор в I г листьев проводят по (формуле:

i/_r S_r ^м

- 35ч -

X - число спор в навеске; а - число спор в одном поле зрения;

S - площадь мазка на поедметном стекле.По условиям методики I см^, т.е. ТОО мм*;

^ - площадь одного поля зрения. При использовании объектива 90 х 1,25 и окуляра 4х она равна 0,02 мм^;

V - разведение » 0,1 , т.к. осадок ресуспендирувт в 0,1 мл;

V, - объем суспензии, нанесенной на стекло. По условиям методики он равен 0,01 мл;

У - масса пробы в граммах;

С учетом значений известных величин формула принимает такой вид:    ^

X » * tJQS'Oi.i- *    —- спор    в    т    г    пробы

0,01.0,02.1,0 2

Пример: масса пробы (У) =1,0 грамм, обработанна как описано в методике, полученный осадок ресуспендирован в обьеме ( V )

0,1 мл, на площадь ( S ) ТОО мм^ предметного стекла нанесено ( К ) 0,01 мд суспензии. Полученный препарат обработали по методике (п. 2.6.). Цри просмотре препарата в люминесцентном микроскопе количество спор в 50 полях зрения составило 2192. Отсюда:

£ 50    2Т92

. 43,84

Подставляя в формулу известное значение, получаем:

X ₃    .    43,84.100^1    .    43,84.10?    .    _{21    92 Т0}5 _

у_г.$_г У 0.01.0,02.1,0    2

«* 2, T9. ТО⁶ спор в I грамме Расчет концентрации спор на плодах проводят по формуле:

X . » , * • L- ISSS , _где и-V “

К» М “ ^{тв же}* ^{что и в} '?°Р^ыУ^ле Яяя

листьев, 1000 - перерасчетный коэффициент для вырапения результата на кг обработанного продукта. После подстановка известных значений формула принимает вид:

х -ail£

2 Ы

Методику разработали: Мельникова Е.А., Пляченко Е.А.