государственная комиссия по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями РАСТЕНИЯ И СОРНЯКАМИ ПРИ мех СССР

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОКОДЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОЗ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ВКЕшНЕЙ СРЕДЕ

Часть XI

Москва - 1961

Государственная комиссия по химичеоким средствам борьбы вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Чаоть Х1-я

Данные методики апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы о вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР

Москва - 1981

2.5. 2.2. Тонкослойная хроматография с энзимным проявлением.

С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) по 2-3 мм слоя сорбента. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные части. На М I-ю и 3-ю полосы на расстоянии 1,5см от нижнего края наносят по 10 мкл стандартных растворов "Б" и "В”, т.е. по 0,001 мкг и 0,005 мкг действующих веществ, на 2-ю и 4-ю - 2 и 10 мкл соответственно пробы. Пластинку с нанесенными растворами помещают в.хро'лтографическую камеру, в которую налита смесь н-гексан - ацетон 4:1 эа 30 мкн до хроматографирования.

Когда фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и дают растворителю испариться. Пластинку помещают на I мин в эксикатор, насыщенный парами брома. Затем после удаления избытка брома с пластинки (^80 мил) ее обрабатывают ферментным раствором и инкубируют в течение 40--50 мин в насыщенном водными парами термостате при температуре 38°С. (для увлажнения в сушильном шкафу ставят чашку Петри с водой). После инкубации пластинки опрыскивают проявляющим раствором и помещают в тор&юстат при 38°С. Метилнитрофюс и фенитрооксон проявляются в течение 10-30- мин в виде белых пятен на голубом фоне, 0,48 и 0,28 соответственно, чувствительность обнаружения каждого 0,001 мкг. П-нятрокрезол этим методом не обнаруживается, Фенитрооксон может быть также обнаружен указашшм методом, если исключить стадию активации; в этом случае чувствительность обнаружения метилгшт-рофоса на 4 порядка ниже.

Количественное определение проводят пут* i сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к кхху ней по величине площадью стандарта. Пропорциопальпая зависимость площади пятна от концентрации соблюдается в пределах от 0,001 мкг до 0,01 мкг. Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:

a - содержание препарата в стандарте, кгмкг - площадь пятна стандарта, мм²

/$2 - площадь пятна пробы, глг

Vj — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл

V - общий объем экстракта, мд

Р - масса пробы, взятой ддя анализа, г

2.6.    Обработка результатов анализа.

Обработка результатов анализа, проведенного методом Г1Х приведена в п. 2.5. 2.1., методом 1X5X3 - в п. 2.5. 2. 2.

2.7.    Настоящие методические указания разработаны U.A.Клмсенко, М.В.Письменной, ВНИИ гигиен*' и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических маоо, г.Киев.

3.    Требования безопасности.

Соблвдаются требования безопасности обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами.

4.    Литература

П.Н.Мельников. Химия я технология пестицидов. Нед. "Химия", М. 1974, о. 518.

92

Стр.

6* Методические указания по определению остаточных количеств рицида "П" в рисе и водо газожидкостной

хроматографией -................. 93

7. Методические указания по определению матилнитрофооа,

фенитрооксона и п-нитрокреаола в зерне и продуктах переработки зерна методом хроматографии в тонком

слое....................... ЮЗ

8. Энзимно-хроматограбический метод определения фоо-фороргэничоских пестицидов в раотителышх продуктах и биосуОстратах .................. 109

тонком слое.................... 118

2.    Методические указания но определению остеточных ко

личеств гербицида малорано в почвах о различным содержанием гумуса методом TGX........... 124

3.    Методические указания по определению остаточных количеств HE-I66 в огурцах хроматографией в тонком

сдое и фотометрическим методом .......... 129

4.    Методические указания по определению остаточных количеств теидекса в воде и почве.......... 136

5.    методические указания по опр делению ФДН    -ди-

ывтмл-Ж-(З-хлорфонил)-гуанидиаа) в огурцах и воде методом тонкослойной    хроматографии ........ 139

6.    Методические укззаиия по определении дитана М-45 в

продуктах питания растительного происхождения и воде ........................ 149

П. Гетероциклические соединения

7.    Методические указании но определению базаграна в

воде, почве, зерне и    растительном    историале ....    152

УЪ

Cip,

6. Uti то диче окне указания по определению фунгицида бай-летона методом ТСХ в почве, корнях,зеленых листьях,

плодах томатов и огурцов..........’.    .    .    159

9. Методические указания по газохидкостно-хроматографическому определению бентазона в почве ч растениях 166

10.    Методические указания по определению диквата в се

менах подсолнечника и масле из семян подсолнечника опектрофотометричеоким методом .......... 174

11.    Методические указания по определению метазина в во

де, почве, овощах и биологическом материале методом хроматографии в тонком одое сорбента....... 181

12. Методические указания по определению остаточных количеств симм-триазиновых гербицидов (симазинэ, ат-разина, проказина, промо трина, семерона, меэорэни-ла, метазина, метопротрина) в почве гээожидкоотной

хроматографией .................. 188

13.    Мотодичеокие указания по определению котофора в семенах хлопчатника методом хроматографии в тонком

слоо....................... 198

14.    Мотодичеокие указания по определению ронстэрт (ок

сидна зона) в рисе методами газовой и тонкослойной хроматографии ................... 205

15.    Методические указания по определению тачигьренэ в

вода методом тонкослойной хроматографии ...... 209

1C Методические указания по определению тербацилэ в эфирных маолэх и эфиромасличном сырье методом газожидкостной хроматографии ............. 214

17.    Мотодичеокие указании по определению трифорииэ в

воде....................... 220

18.    Методические указании по определению остаточных ко

личеств текто(тиабанда зола) в картофеле и свекле тонкослойной хроматографлей............ 227

19.    Методические указания но определению остаточных ко

личеств фона зоне в почве, воде, свекле и растительных обьоктах газожидкостной    хроматографией ....    234

Прочие пеотигиды

I. Методические указания по определению остаточных.

количеств хлората магния полярографическим ue-wov ••• 2чЗ

2.    Методические указания по определению нортроаа в

ьодо, черноземной почве и сахарной свекле ............ 2**8

3.    Методичеокие указания по определению содержания

общой ртути в **чсе, яйцах, рыбе, молочных продуктах, ПОЧВ", .....*..................................Zj'J

Бактериальные пестициды

1.    ?Летодические указания по определению микробиологи

ческих инсектицидов не прямым иммунофлюореогентним методом ..............................................268

2. U*годические указания по определению виталичина А

j воздухо м'етодом тонкослойной хроматографии.........276

3* Методические указания по определению полиэдров» вируса ядерного полиэдроза капустной совки на растительных объектах иыыунофлюоресцентным методом ....... 260

тов в воде, почве и растительном материале ......... 289

2. Методические указания по ^пределе*чю актеллика

растительной продукции, почве и воде ................. 296

Настоящие методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-иоследователь-ских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токоикологичеоких лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других Министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пео-тицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде*

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомио-сии по химическим средствам борьбы о вредителями, болезнями растений и оорнпками при МСХ СССР. (Председатель группы экспертов М.А.Клисенко).

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования оанэпидслужбы ИМПиТМ им.Е.И.Ыарциновокого и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минэдрава СССР.

"УТВЕВДАЮ"

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР

И.Зайченко

28 января 1980г.

*2132-80 -

Методические указания по определению метилннтрофоса и фскитрооксона в зерне и продуктах переработки зерна хромато-энзимным и газо-хроматографлческим методом

L.Краткая характеристика пестицидов

Meтялнитрофос -0,0-диметил-О-(3-метил-4-нптрофешш)-тиофосфат

N0.

\-^f    С9^Н12°^^РЗ

Мал.

масса 277,2

Синонимы: метатион, суштион ,фенитротион .фолитион, польва-дофос,вататион,динатион,новотион, препарат 566П0, Байер 4I83I, агратион-20.

Химически чистый препарат - светлая кидкость со слабим неприятным запахом. Т _иш 95°С при 0,01 ш.рт.ст.; плотность 1,308; коэффициент преломления 1,5505; давление паров при 20°с - б.ПГ® ; .4 рт.ст.; летучесть 0,82 ыг/м³ при 20°С;

2,33 мг/м³ при 30°С; 6,11 мг/м³ при 40°С. Растворимость в воде около 30 мг/л, хорошо растворяется в большинстве органических растворителей.

Препарат гидролизуется в щелочной среде ( в 0,1 н. NaOH при 30° С период полураспада ЗС минут). При нагревании выше 100°С изомеризуется и может разлагаться со взрывом. Хранить препарат необходимо в эмалированной или стеклянной таре, железо способствует разложению препарата. Выпускается в форме 30 /С-пого к.э. и 50 %-аото к.э.

1ЩК в воздухе рабочей зоны 0,1 мг/м . ДОК в полевых культурах утверждены 0,1 мг/кг. В настоящее время рекомен-

84

дованы ДОК в эерне Т мг/кг, муке 0,3 мг/кг, хлебе ОД мг/кг. Применяется в качестве контактного инсектицида и акарицвда дня борьбы с водителями овощных, технических, плодовых культур, обработки незагруженных зернохранилищ, рекомендован для обработки зерна,

Фенитроокеон - 0,0-диметил-0~( 3-метил-4-нитрофонил) -фосфат - токсический метаболит метилнитрофоса

^9^Н12°6^{М Р}

\ — /    Относ,    мол.

масса 261,1

В чистом виде - светлая жидкость со слабым неприятным эадахом.

2. Методика определения метилнитрофоса и фенитрооксона в у^?<?,^е"хлебе, отрубях хромато-энзимным и газо-хроматографическим методом,

2.1,    Основные положения

2.1.1,    Принцип метода

Метод основан на извлечении метадшшюфоса (МНФ) и его токсического метаболита фенитроокоона из*муки,хлеба,отрубей смесью органических растворителей (н-гексан - да этиловый эфир 7:3), очистке охлажденным ацетоном и параллельном определении их в аликвотных частях пробы методом газо-жидкостной хроматографии и хроматографии в тонком слое о энзимным проявлением.

Газо-жидкостной хроматографией (ГНХ) определение проводится на хроматографе марки "Цвет" с термоионным детектором (ТИД) с использованием в качестве неподвижной фазы Ъ% £Е-30 на хро-матоне Л/-АУ~ДМС^ ,газа-носителя - азота.Этот метод позволяет раздельно определять метилнитрофос (Суд_в 3,8) и фенитрооксон (t _уд 3 "кинуты); чувствительность определения каждого -0,001 мкг (т.е. 0,02 мг/кг при навеске муки, хлеба, отрубей 20 г). Количественное определение проводится по высоте пиков. Определению фенитроокоона мешает присутствие метафоса (t уд 3,16 мин) .Для идентификации в этом случае попользуется хрома-^то~^эн?онЖсло§н8^1роматографйческое определение с энзимным проявлением (ТСХЭ) основано на разделении соединений в тонком слое силикагеля КСК с подвижной фазой н-гексан - ацетон 4:1 и обнаружении их по способности угнетать холинеотеразу

65

(ХЭ). При этом идентификация их проводится как по величинам Kf (R^ МНФ 0,48, фекитрооксона 0,28) так и по условиям обработки. Так обнаружение фенитрооксона, являющегося Р=0 аналогом метшшятрофоса, может быть проведено непосредственно после обработки пластинки субстратом, а для обнаружения МНФ необходима предварительная активация пестицида па пластинке бромом. Этот метод позволяет раздельно определять МНФ и фе-нитрооксон; чувствительность определения МНФ без активации 0,10-0,15 мкг, а с активацией бромом - 0,001 шсг (0,02 мг/кг) чувствительность определения фенитрооксона без активации 0,001 мкг (0,02 мг/кг). Определению метиляитрофоса мешает метафос (1Ц> метафоса 0,4? ).

2.1.2.    Метрологическая- характеристика метода:

-    Диапазон определяемых концентраций 0,5-50 шсг ЫНФ и фенитрооксона в анализируемой пробе;

-    Предел обнаружения МНФ и фенитрооксона 0,001 мкг (0,025" мг/кг);

-    Размах варьирования для МНФ и фенитрооксона 80-85# -методом Г2Х и 75-105# методом ТСХЭ;

-    Среднее значение определения стандартных количеств МНФ и фенитрооксона 81# (Ш) и 89# (ТСХЭ);

-    Стандартное отклонение при гас 4,2#, при. ТСХЭ 8,3#;

-    Относительное стандартное отклонение при ПОС - 0,05, при ТСХЭ - 0,09;

-    Доверительный интервал среднего при р=0,95 и п =5 для МНФ и фечитрооксона методом ШХ 81*4,9, методом ТСХЭ -89*9,8#.

Сочетание указанных методов позволяет идентифицировать метилнитрофос и фенитрооксон в присутствии близкого к ним по химической структуре пестицида метафоса.

2.2.    Реактивы и растворы

Основной стандартный раствор пестицидов (А) - смесь стандартных растворов метилнитрофоса и фенитрооксона по 100 мкг/ыл каждого (по 10 мг каждого вещества растворяют в ацетоне е мерной колбе емкостью 100 мл).

Рабочие стандартные раствори готовят разбавлением основного раствора "А".

Раствор "Б" - 0,5 мл раствора "А" доводят в мерной

86

колбе до 100 мл ацетоном (содержание каждого вещества составляет 0,5 мкг/мл).

Раствор "В" — 5 мл раствора "Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание каждого вещества ОД мкг/мл).

2.2.1.    Для экстракции Н-гексан, х.ч.

Диэтиловый эфир медицинский Ацетон, х.ч.

Фильтры бумажные (красная лента)

2.2.2.    К методу ШХ

Стационарная фаза - метилсиликоновнй полимер S'E-OO в количестве % на хроматоне N-AK/^MCg , 100-12) меи

Водород

Азот особой чистоты, (содержание 0₂ ^не Д°лжно превышать 0,0032)

Стекловата

2.2.3.    К методу ТСХ с энзимным проявлением Силикагель КСК, раздробленный и просеянный через сито

100 меш

Кальций сернокислый (CaJ> О^ЗД^О), прокаленный в течение 6 часов при 160°С Бром

Индоксилацетат, ч.д.а. ТУ-7П-57-69 Калий хелезосинеродистый - 0,05 М раствор Ц,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды)

Калий хелезистосинеродистый - 0,05 М раствор (2,110 г -в 100 мл Н₂0)

Ортофосфорная кислота, х.ч.

Борная кислота, х.ч.

Уксусная кислота, ледяная Едкий нххт натр, х.ч.

Буферный раствор рН=8,69 - готовят раствор смеси орто-фосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до I л. Для получения буфера с рН=8,69 к 100 ил указанного раствора прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,800 г //аОН в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора I г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора z фильтруют через вату. К I мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.

Проявляющий реактив: 10 ыг нндоксилацетата растворяют в б мл этанола, прибавляют 6 мл дистиллированной воды (рН=8,69), 2 мл раствора железосинеродистого и 2 мл желеэис-тосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На пластинку расходуется 3-4 мл смеси.

2.3. Приборы и посуда

2.3.1.    Для экстракции

Колбы конические плоскодонные с пробками, емкостью 250 и 100 мл

Воронка фильтровальные

Ротационный испаритель о набором колб емкостью 50 и 100 мл

Пробирки мерные о пробками емкостью 5-10 мл

2.3.2.    Для Ш

Хроматограф марки "Цвет" с терыоиошшм детектором Баллон с азотоМ особой чистоты Баллон с водородом

Колонки стеклянные, длина -1м, внутренний диаметр -

3 мм

Микрошприц на 10 ыкл

2.3.3.    Для ТСХЭ

Стеклянные пластинки размером 9 х 12 см Камера для хроматографирования Пульверизаторы стеклянные Камера для опрыскивания

Компрессор или баллон с азотом гли сжатым воздухом для равномерного мелкодисперсного опрыскивания пластинок Пипетки на I мл, 5 мл, 10 мл

ВВ

Мерные колбы емкостью 25 мл, 100 мл Мнкрошириды на 10 мкл или микрошшетки до 0,1 мл для нанесения стандартных растворов и проб

Термостат СШ-35 с температурой нагрева 37-40°С

Ступка керамическая

Эксикатор

2,4. Подготовка к определению.

2.4,1. Подготовка колонок для ГЬХ.

Используют готовую фазу Д'Б-30 Ь% на хроматоне V-AV-ДМСд.

Вели нет готовой фазы, 0,7 г S В-30 растворяют в небольшом количестве хлористого метилена и прил:¹ тют в круглодонную колбу со шлифом, в которой находится 14 г носителя (хрома-тон //-AW-ЛМС^ ), залитого полностью тем же растворителем. Тщательно перемешивают всю массу и выпаривают растворитель на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток подсушивают в сушильном шкафу 4 часа при температуре 80°С. Приготовленный носитель хранят в склянке с притертой пробкой.

Для заполнения колонки один конец ее закрывают стеклянной ватой, а в другой через воронку засыпают носитель. Заполняют колонку постукиванием, закрывают второй конец торшоном из стеклянной ваты.

2,4,2, Приготовление пластинок для ТСХЭ Для приготовления 12 пластинок берут 35 г силикагеля КСК, 2 г сернокислого кальция, приготовленного как описано выше и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течении IB-20 часов при комнатной температуре, храпят в '.ксихаторе.

2.5. Описание определения метшшитрофоса и фенитрооксо-на §?м^е₍ отрубях, хлебе.

2.5.1. Экстракция

Для проведения исследований отбирается средняя проба зериа^ муки, отрубей, хлеба весом I кг. Из каждой пробы (хлеб измельчают) для^апализа методом квартования отбирается три навески по 20 г^о^г/Пробу заливают 50 мл смеси н-гексая -диэтшювый эфир 7:3 я оставляют на час, периодически встря-

89

хивай. Сливают растворитель через фильтр, пробу заливают новой порцией экстрагента и экстрагируют еще час. Объединяют обе порции экстракта, сушат безводным сернокислым натрием в течение 15 мин и переносят в прибор для отгонки растворителей. Упаривают растворитель до объема +*1 ш под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45°С, т.к. летучесть МНФ резко увеличивается с повышением температуры. Остатку растворителя дают испариться па воздухе при комнатной температуре. Сухой остаток смывают охлажденным при 0°С ацетоном и, фильтруя раствор через бумажный фильтр, переносят в мерную пробирку. Оставляют на 15 мцч, а затем жжрнхвэе пи доводят объем ацетона до 5 мл при комнатной температуре. Из этой пробы проводят определение методом ТЕХ и ТСХЭ.

2.5.2. Метод аналитического определения

2.5. 2.1. Газо-жидкостная хроматография.

Условия хроматографирования. Шкала электрометра 2*10~¹⁰а4 Скорость движения ленты самописца 200 мм/час. Температура колонки 190°С, испарителя - 220°С. Расход газа: азота 22-24мл/минз водорода 15-17 мл/мин; воздуха 24 л/час. Вводимый объем 2-5 мкл раствора. Линейность детектирования соблюдается для метшшитрофоса в пределах от I до 10 нг, для фенвтрооксона от 0,5 до 6 нг.

Время удерживания препаратов: метилнитрофос 3,8 мин; фенитрооксон 3 мин; время удерживания по ыетафосу: метил-аитрофоса 1,2; феннтрооксона 0,95.

Содержание препаратов в пробе вычисляют по формуле:

X - С * У* Н * 1000 V_a * На • Р

X - содержание пестицида в пробе, мг/кг С - количество пестицида в стандарте, мкг Va - объем экстракта, введенный в хроматограф, мкл V- общий объем экстракта (5 мл), мл П - высота ника пробы, мм На — высота пика стандартного раствора, мм Р - масса пробы взятой для анализа, г