МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ НО ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРАМОТРИПАТЕЛЬНЫХ НЕФЁРМЕНТИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Главное саиитарно^агшдемиологическое управление

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРАЫОТРИЦАТЕЛЫйК ШФЕРШПШЩК ЮУХРООРГАНИЗМОВ

Москва - 1995 г.

- 8 -

выдергивать посевы па среду яри комнатной 'температуре 2-3 суток*

3. Реакции н реактавн.

3*1. Ct разные реакции.

ЗЛЛ. Реакция окслдазы ло Ковачу* Реактив: мтрелютта-пфа-феядлэнднаыин хлорид 0,6 г; вода 100,0 т. Реактив наносить платиновой иди пихрошой цстлсф на колонию (макроколсщию) * Лоложи-тельная реаквдя - порозовеняе, а затем обшивание в глубокий фио-тотсвый цвет* Альтернатизно - пропитать фильтровальную бумагу неактивом и наносить на нее микробную массу из макроколонии. П6-ложиггельный результат тот же.

ЗЛ 2. Реакция Цитохромоксццазы. по Гэби и Хедлд. Реактивы:

/I) аяьфа-тнаргол 1,0 г; етанол 100,0 мл; Б) Дшютил-парз-фенллен-диамия хлорид (для оксалат) 2,0 г; вода 100,0 мл. Реактивы хранить раздольно в холоднтънюсе* олшвватъ неболшимк цордаяык непосредственно перед употреблением. Способы Применения те же, что в п.ЗЛЛ* Результат - при положительной реакции колония ш микробная масса на фильтровальной бумаге приобретает сигай (ультрамариновый). цвет.

ЗЛ*3. Реакция окендаэы по Ковачу рекомендована специально для нофаршнгируших микроорганизмов; реакция цт^схрошкондазы но Гэби и Хэдли - как для неферментирувдвк, так я преимущественно для ^ерментируюотх микроорганизмов (аэромонцд, плеэиомонед# вибрионов) ♦ Б СССР распространен в основном метод Гэбж ж Хэдли (цнто-хромоксцдаза), Неправильно трактуемый некоторыми как реакция дасоцда-вы, хотя последний термин должен быть прслэнен и реакции о тетр&-гтилчхара-фвиитапдшняаом. Некоторые микроорганизмы дают различные реакции с тем я другим реактивом (см.таблицу I).

G.2. В некоторых случаях возникает необходимость определять принадлежность изучаемой культуры к граютрицатвльиой группе* С

oo

I*

- 9 -

этой це.ша, микробную массу с сведей агаровое культуры петлей вносят в 3# водный раствор КОН. Грамотрнцатедъные ыцкрооргенззш после поскольку секуцд перемешивания массы в растворе осшшняит-ся К за петлей тянутся трудно отрывающиеся нити. Этот феномен отсутствует у грамполонитзльных микроорганизмов.

4. Систематизированные таблицы ключевых признаков НМ.

4.1* Обоснование систематизации и подбора ключевых признаков. При отборе ключевых признаков были учтены основные* имеющие мэдд-цинское и санитарное значений, вефершнтдрупцие микроорганизмы. -Kw^Ti немногие из включенных в набор признаков у некоторых НМ нестабильны, являясь решающими в отношении других НМ (например оксидация мальтозы, продукция своо^годно?о азота). Принятый набор обеспечивает надежную идентификацию большинства НМ и дашь для уточнения некоторых необходимы дополнительные тесты*

4.2. Схема последовательной первичной здентифнкавди неферментируыцих микроорганизмов.

0/0

+/0

0/0

+/0

-10-

4.3.    Систематизация признаков выявила три основам: группы

ШМ:

1.    Пштрожжсвдша-отрщагелышв, делящиеся на подгруппы

1а. Не оксидирующие глюкозу (цесахароллты);

16. Оке ад иру шие глюкозу (о ах ар о литы).

2.    Пит ох ромок сид аз a-положит сльнио , но не оксидирующие глюкозу.

3.    Питскрошксидша-лоложзиелънш, оксидируетдо глюкозу (оаха-ролиты).

В подгруппах первой группы и в 2 и 3 группах дальнейшая дк$н фвренидадЕЯ проведена до двум другим решает им. ключевым признакам -оксидации мальтозы и подвижности. Комбинации этих четырех решающих клшевшс>ярлзнаков выявляют подгруппу третьего порядка, кацдая состоят из дешогнх видов, дий^ренцпацш которых по остальным ключевым признакам к, в отдельных случаях, по дополнительным тестам, не составляет труда, f    ь)

4.4.    Пользование таблицами. Из п.4.1 следует, что после получения чистой культуры КфМ с селективно-дий^ренциальной среды ж отсева ее кд среду Кинг-А для выявления и исключения из деисьней-шего изучения фенвзннн>бразувдлх (пигментных), р.оет^тюзог рекомендуется посев ыакроколоннгщи в чашке), определяется отношение к реакции цитсосромаксвдазц. Одновремэннб с росевом на сроду КжнГ-А производится посев в среду О/С, Эти д^а теста - р^цнтохро-моксидазы н оковдатявно-фермэнтативная реакция, позволяют определить пршададхность изучаемого микроорганизма к той или иной группе уга через сути после инкубации при 36-37°С шш через двое суток после инкубации при 30°С. Остальные ключевые признак* могут быть определены одновременно, но в целях экономии труда и сред предпочтительно на втором этапе выявить отношение к мальтозе, подвшаюсть и характер роста на нитратной среде (при 42°С п при 35-37°С) _$ учитывая диффузное помутнение среди при положительной нитратазной реакции, рост на поверхности среды в виде плотного

о

\v\

- II -

кольца 'iipu отрицательной нитратаэной реакции и продукцию свобод-цого азоте), после чего при некоторых комбинациях этих признаков становятся изл;ьшищ остальные тести, либо намечается необходимость в цроводонян лишь некоторых из нлх, а иногда и использование рекомендуемое дополнительных тестов.

4.tu При массовых исследованиях лдэгут быть выявлены культуры, не укладывающиеся в предлагаемый набор признаков. В зависимости от обстоятельств, такие варианты подлежат дополнительному язуче-ншо (если это вызвано необходимостью), либо исключаются в тех случаях, когда с-тоЙ.;:е солсЕЛтИвно-д^еренцдальной среды сняты другие колонии, полностью отвечающие той или иной комбинации ключевых признанной л, следовательно, адентифицируемых как той или иной ЯШ.

5. Ориентиры основных нефершнтярукщшс микроорганизмов

5.1. Включенный в таб шцы набор не исчерпывает обилия нефер-монтирующих микроорганизмов, обитающих в окружающей среде. Отобрали лишь имеющие медицинское л (иля) санитарное значение ®М, а такие сапрофиты или фитопатогены, от которых их нуцно длффврви-цировать. Характеристика включенных в таблицы НИ и их ключевые признаки доны в соответствии о литературными данными последите лет и ва основании собственного материала. В таблицах представлены

РОДЫ Paendomonas _f Aolnatobaotar Korsiell* _e ОТДЭЛЬНЫО представители родов BoTdotella , rievoonotarl'.jn _f Aohroreobnetar, /loallgenaa    8    ТШЛСе ZoojrXoae t

Xantboaonna , Рыгвоооома , В ТабЛИЦЦ НО ВКДЮЧОНЫ ПРОВИЭО'Р** цые группы И "Ш" В родо Moraiellfl ,    "    Y4-1    "    ,    *    w~2⁴t

^п Vd-J “ ( AgrobflOtar Гп.ПоЪяоter ) В рОДГ Aobroraobaotor _f “ ХУе^я, "1Уе-2" В роде Bordetella    ,    как ишшие лишь

единичные ключоьцо признаки, отличавдие их от легализированных

в адов.

- 12 -

5.2* Род Paaudoraonpe БКЛЮЧЙ9Т 265 ВИДОВ, зэ которых по основным свойствам охарактеризован! 32, не считал фитопатогенных п тиорскпх псевдомонад. Б таблицы включены наиболее часто встречающиеся н имвиянв мэ^ицшское значенко или сщулнрущие их 10 видов сахаролитоа и 6 кесакаролптов. Наибольший интерес представляет группа флуоресцируадих псевдомонад ~ P.oer^itioee *«Пчогвззепа н F.putHa , которые диф£ ерешцдауотся На основании ключевых признаков - глубокой редукции нитратов-нит-ритов с освобождением свободного азота вря 42°С и при 35°С, жала-тнназной реакции, рооте на среддх Ккпг-А ж "блеск". Эта же тес-ты, как и некоторые дополнительные, могут окупить ориентиром после определения основных ключевых признаков - р. цит охромоковда-зы, Оксидации глгаозы ж мальтозы, и для остальных Представителей рода.

5.3.    Aotnetobaoter oaloceoetlouB , В практических целях удобнее изменить номенклатуру этого единственного вида рода

AoinntobacXftr    , считая его подвиды ва самостоятельные виды:

A.lwoffl * A.anltraVjs    >    A(с ДВУМЯ вариантами - heeraolytlotie ж ftloalleeneB    ). Все ОРИ

щггахромоксадаэ6-отрицательны, неподвющк, утилизируют в минеральной ореде этанол и, в зависимости ст вида_# глюкозу к (или) ацетат натрия. Ключевые признаки для J .*nitrateа    -    оксидация 10{5 лактозы, ДЛЯ A,bae*Olytloni    -гемолиз* гидролиз

желатина ж продукция лзцитпнаэы»для A.l*offi    -    отсутствие

всех этих свойств, но способность утилизчровать ацетат натрия и этанол в минеральной среде.

5.4.    Род MoraxeUa представлен 7 видами. Общие ключевые

признаки: р.цитохромоксидазы положительна, подвижность и окисление ГЛЮКОЗЫ И другпх углеводов отсутствует. M.oaloansle    и

M.nretbraiia способны утилизировать ацетат натрия в минеральной ореде без дополнительных ростовых факторов, различаясь по способ-

- 13 -

ноотя ассзаиющровать цитрат натрия, е M^tientp* не утилгзя-руеТ НЯ ТОТ, ЦД Другой ИСТОЧНИК С. М.Ъот1в Н M.l^ounatP расщепляют желатин, но последняя для проявления этой активности требует добавления к среде кровяной сыворотки шш солей жирных* кислот с высоким содержанием атомов углерода (бутират, кацрат).

обладает выраженной гемолитической активностью, а при нспвдьэаванЕк "шоколадного* агара гемолитическую активность проявляет и B.Zaaiineta * КОТОрая, В ОТЛДЧйе ОТ М.ЬсггГв продуцирует нэтратасу, как к к.попНопчГаоХвп» и в меньшей степени к ^ph^nyXpyvnYica    .    Последняя    деадкннрует    феняяа-

лашш к триптофан. Спорным является наличие фенкледанна-деамнаа* ЗЫ у M.uretbrellfl . И, наконец, M.buVle    я    Sl.Xeonnata

различают свернутую кровяную сыворотку. Провизорная группа "ЬЙ" будучи сходной -о м*оз1оапа1ч по большинству ключевых прнзна-ков, отличается до отсутствию способности утилизировать ацетат натрии в минеральной среда. Группа "Мб¹¹ отличается от прочих видов моракселд по отсутствию каталазы.

5*5* A^hronobflftter xyio^DJfidens _ъ дмодацдШ в группу цито-

хромоксдцаза-положиталтос неенхаролиТов, оддисгвепшш в этой

*

группе кос’щируот Козлову, особенно чоя'но яра Ш/з концентрации последней, Провюорнне грушш этого рода " v<s-i ", "Vi-я ”

И " td*3 "    (    Afcrobaotor    redLoosotsr ) ОТЛИНОЮТОЯ ОТ

а*ху1овозг1<Зчпв    по энергичной урааэной активности, послед

ние две по оксидации сахарозы, мальтозы и шитта,

5#б. Flavobnotorina menlnpoepTjtteun отлпчаотся ОТ СХОДНО*! с ним по Другим признакам $ы*"&omonna cepaola    по

отсутствию оксидации сахарозы, а от сходных видов рода AobroraobHOtar    Д НрОВИЗОрНОЙ Группы    "    НО    ОКСДДаЦИЦ

цаШГНТа. Ддя ЭТОГО Н£Ы, -KfiK U ДЛЯ P.WfiltophiUa    к

V*o«peoie хцрагтеров двоякое отиошепиа к оксцдезиой реакции; Qd}\ положите льни по оксядаэо я отрщателады по цдаохрошксадазе*

-14-

5*7* Бедк рода Rcraatoiin    _f в    цгп'олро-

г.тсшсазноЛ реакция расположены п Нарвой и в?орК1 таблицах. Отличий пх от сходных К&М других р&шэц даны в таблицах* Бщ в, p^rimss* н исключен из таалпц, как требующий особью методов хультав^фования.

Для B.bramhia^pti оа характерна высокая уреазыаг. активность (гидролиз мсчвзиш* в порше 4 часа кякубацш) к отсутствие утилизации цитрата натрия н минеральной среде (потребность в донолкктель-них факторах роста)* в отличие от провизорной группы ^и1У-2о", аоси№Тлрущей цитрат натрий. Провазорнал группа "1У9^П отличает -сл от s.bronoMaeutica    по    редукции    нитрата    до    образования

свободного азота.

5*6. Наболев распространенный п изученный вид роде а1срИ*

—-Л-оГавоаНа ₍ ОТЛИЧАТСЯ ОТ СХОДНЫХ о НИМ P.scldovinms по утилизации цитрата натрия* а от B.bronohisopMoe    по    от

сутствию уреазной активности. Виды Л.ояогапэ и лЛ1дчвг_Ве>пв объединены в таблица 2 с A«fe*oaUs _t поскольку ключевыми признакам этих видов (по Вогану - ещолимов \₉т**срИв случат нитрат азная активность и выделение при редукции нитрата,

( ' A.rtenitrifieene ) га нитрита ( а*о<|пгйпр ) свободного азота. Одаако, шггратаза обыаруяэпа и у 43-02? A^fneceiis свежа выделенные штаммы которого могут такде выделять свободный азот. ЗяДЦ А.рягаДотиа , A.o^troptnia И А , вц'шщэуtn^ie необычны по оксидации глюкозы, а последний и мальтозы, к включены в таблицу 3 как подлваяцие дальнейшему изучению « позиций их принадлежности к роду ?а«чбопопм    (сходство    в строении

ДНК).

Методические рекомендации разработку Московским ордена Трудового Красного ьпамани *гоучночгссд9лопа?0лъакнл1 'институтом гигиаш км.Ф.Ф.Эрисмана (д.м.н. Г.П.Калина, к.м.и, Л .^.Виноградова, п«м*н* Г-М.Трухина).

Методические рекомендации рассмотрены Лабораторным Советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР и рекомендованы к утверждению.

Рекомендации предназначены дял использовании ъ практике бактериологических лабораторий гигиенического и опидемиологи-ческого профиля научно-исоледоьателъсккх институтов, медицинских институтов и, по показаниям, республиканских, кредмде, областных ^и городских санитарно-эпидемиологических станций,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ъ дели облегчения хкоптификации ввдаллегих при лсследова-идпх объектов окрудакыеЙ среды граг^трш^итэлъных йеформэнтиру^цих мХир сюргапкзмсв (ШЭД, представллвдш: медицинский (,эпидемиологк-чеоьлй) и оаллтарвдй (гнгиечичоскиИ) кит ере с, дро/тд'едаоя наиболее сгуцгчтвелные ключевые признаки, оаатьца?:хзирэг1 ныуе до основу ним рушащим ключовшд яризнаком на группы; I. Циохромоковдаза-етряцатвяьпых Н(Ш; 2. Цитохромотсс ода^а-Д сложит вдъных не окслди-рушюс глюкозу (несахарялитов) ИЩ к 3, Цятохромоковдаза-яолаш-толышх, окглдафухщмх глюкозу (сехградйтоъ) ЩИ* о л одр отделе илем б каддоЧ группе на основе оксидации ыадьтоеы к подлинности на под-* групп ж с посхшэдуюцчм использованием других ключевых признаков. Применение такой систематизированной дденпфлсацуи, основанной*ид вэбсирдок наборе тестов, дозволит ориентироваться в большой количестве разнообразных до сбоим свойствам НФЫ и диффоренцировать их от еалро Гитарных и хемоллтотрофных ШЭД об пташке в воде и~^очва ₊

Достаточность данного набора ключевых признаков длл идентификации осдошшх, шлещдх медвцшскоо д санитарное значение нефер-меитпруших микроорганизмов, обоснована изучением большого количества штамме, л КШ, выдолештых на протяжении трех лет кз води поверхностное водоемов, сточншс зкмдаоотвй я. объектов окружении большое в лечебных учрездехШгос.

Ограниченный набор предназначенных для днентг^пкащш Hffli методов д питательных ород, не тробуицих епедоальпого лабораторного оборудования, дефицитных, импортных длл дорогостоящих реактивов л материалов, можот быть дсполъзсшгш по только в лабораторных ноучнсьисслодэвотвльскщ институтов и кафедр гиглопического и Э1:ндиииологичоского профиля, но п в сапиторно^цадемиолопноскюс оттциях по соответствующим показаниям*

Л    oi^r/Обьм    Тир

Тиш*(**4*4* Мн*и>'Г'р£т«* эд,»*жир*ммм* СССР

•TTBEPUAD"

Начальник Главно го'чпнигарно-эш!-дамиодогического управления Министерства зправойхранения ССОР /9    Б»£ * Ко вди л о

еГй I9Q5 год

» 39Я -и

Методические рекомендации по идентификации грамотрица тельных нефермвптнруовдх микроорганизмов*

I* Введение*

Й последние годи внимание гигиенистов и влкдемиологов привлекает обширная группа граыотрчцьтельных неферментн-рувщих микроорганизмов /НФМ/, широко раопроо гране иная в объектах окружающей среды* Доказана пагогенносгъ о^ннх

/Bbeudoaoaaa аигщДпоа* _t£ordatellu увг *иьвЫ ,1 lavQbactvrlu* 4(ш1|ц,о1>

DBpticuft_luot'axoiiu laouunt*/ и роль в патогенезе заболевай человека И ЖИВОТНЫХ других ЙФМ / A«in«tufci*eter 5aldow;eticqj,

aordateUtt broiiiUiflftHticiL^dhrouoUbcter xyijbO'Udatt*,aoTduleli*

Однако^аотое нахождение многих из них в кишечнике чеьовека овкдоувльатв/ет о возможном их индикаторном значении.

Поэтому возникла необходимость й оистемагике НФМ,& также уп-ро(ценных ж доступных для яирохих иосдедовайий идентификации микроорганизмов,обнаруживаемых при исследованиях поверхности них и подземных вод.воды централизованного водоонабжения, о точных жидкостей,почвы,смывов с предметов окружения больных в лечебных учреждениях и в патологическом материале*

В основу идентификации положено систематизирование признаков по огепени их значения,дополненное тестами, необходимыми

- a -

п отдельных случаях для более четкой идентификации того или иного 1Ш, имлетего медицинское и (или) санитарное значение, и дтн дифференциации последних от хемолиготрофных и сапрофитных НИ, широко распространенных в воде и почве. В предлагаемом виде с Денным набором клхяевых признаков и количеством идентифи* цируемых НФМ предлагаемая схема разработана в СССР впервые.

I. Лабораторное оборудование, реактивы, материалы.

1.1.    Основы питательных сред.

1.1.1.    Агар микробиологический. ГОСТ 17203-71.

1.1.2.    Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия Г71-81.

1.1.3.    Ыолоко коровье пастеризованное. Технические условия 13277-79.

1.1.4.    Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия 13805-76.

1.2,    Реактивы.

1.2.1.    I-нафтол. Технические условия 5838-79.

1.2.2.    Натрий уксуснокислой 3-водный. Технические условия 199-78,

1.2.3.    Реактивы. Калия гидроокись. Техкяческиэ условия 24363-80.

<СТ 03В 1439-78).

1.2.4.    Джметкл-пара-фенилендяашн ТУ 6-09-18-28-72.

1.2.5.    Калий азотнокислый. Технические условия 4217-77 (СТ .C3BI697-79).

1.2.6.    Аммоний 'ернокиолый. Технические условия 3769-78.

1.2.7.    Калий сернокислый. Технические условия 4145-74.

1.2.8.    Магний сернокислый 7-водный. Технические условия 4523-77.

1.2.9.    Тетрацетил-дара-фецдлйндяамид ТУ 6-09-18-28-72,

X.2.I0. Катай фосфорнокислый однозамещешшй. ТУ 4198-75.

1.2.II. Калий фосфорнокислый двузвмещенный 3-водпый. Технические условия 2493-75.

- 3 -

1.2*12. Натрий-аммоний фосфорнокисши двузашценчый 4-ьодный.

Технические условия 4170-78.

1.2,13. Аммоний хлористый. Технические условия 3773-72.

1:2.14. Магний хлористый 6-водный. Технические условии 4209-77. 1*2.15, Натрий лимоннокислый трехэамсденный, ТУ 22280-76.

1.3.    Углевода, спирты.

I.3.I* Д-гдкжоза, Технические усювил 6038-78.

1.3.2,    Глщернн. Технические условии 6259-75.

1.3.3.    Ксилоза ТУ 6-09-20-45-77.

1.3*4% Лактоза ТУ 6-09-22-93-79.

1.3*5. Мальтоза БТУ 257-59.

1.3.6. Спирт эткя<?ый ректификованный, ТУ 5962-67,

1.4.    Красители, индикаторы.

I.4.I* Бромгишловый синий* ТУ 6-09-20-45-77.

1.4.2.    Индикаторы. Феноловый красный. ГОСТ 4599-73,

Х.4.3. Хлорид 2-, 3-, б-трафензиггегразола. ТУ 6-09-38-38-78.

1,6* Лабораторное оборудование, посуда, материалы,

1,6Л. Посуда и оборудование лабораторные, стеклянные. Тнцы*, основные параметры и размеры. ГОСТ 25336-82 Е <СТ СЗВ 2945-81),

1.6.2.    Термостат электрический о автоматической терморегулировкой до 60°0 с термэметроы ценой делении 0,2°С.

Г.5.3, Проволока кз никелевого и медноникелешо; сплавов длп удли-нягщих проводов к термоэлектрическим преобразователям*

ТУ 1791-54*

2. Питательные среды.

2.1. Среда для определении оксидации ж ферментации глшози (0/Ф). Пертон 2,0,* хлоркч Куприн 5,0 г; 2-зашцениый фоофат калия-0,3 г; глюкоза 10,0 г; агар 4,0-6,0 г« I,6jC щелочной раствор феи#-*-

лов ого красного 2,5 мл; вода до 1000,0 мл.; pH 7,4-7,6. После растворяйся ингредиентов раэ’шть в пробирки в количестве, достаточном для получения высоты столбика не шнее 6 см (лря&врйо 7,6-8,0 мл.). Посла стерилизации при 0,5 атм 15 ЙУ, охладить в вертикальном положении. Посев иглой Сне короле 6-7 см) уколом до дна пробирки. Инкубация 35-37°С 18-20 часов или 30°С 42-44 чара. Пожелтение всего столбики—оксидация и ферментация положительны (+/+), пожелтение только верхней части столбика, иногда всего 1,5-2,5 см. от поверхности, оксидация без ферментации (+/-)* отсутствие досвлтешщ всего столбика и, как правило, щелочение (малиновый цвет) поверхности среда - отсутствие ферментации и окондации (0/0), В некоторых слу лх наблюдается пожелтение низшей половины столбика при ,малиновой адресно верхней, что может быть следствием шсакой протеолитической активности, в результате чего образованием кислоты за счет оксидации глюкозы сменяется щелочением в результата интенсивного растепления пептона.

2.2. Определение нзггратазной активности. Пептон 20,0 г; хлорид натрия 5,0 г; нитрат калил 2,0 г; агар 1,0-3,0 г; жидкий дрожжевой экстракт 200,0 т; вода до 1000,0.мл. Разлить по 4-6 мл в пробирки, стерилизовать при I атм. 20 мш. Посев уколом до дна пробирки. Процесс воостаношгошш нитрата может идти о различной глубиной реакции - от восстановления нитрата в йитрнт, до редукции последнего до выделения свободного азота. Литрет-редукгаэнач активность способствует утилизация кислорода в анаэробных условиях и длффузноьу росту тггратаэа-активЦшс НИ в среде. Нэактивные НВД растут в стой среде лишь на поверхности в виде более или иэнее толстой пленки. При завершении редукции нитрата и нитрита до конечного этапа - образования свободного азота, в среде данного состава В толще я на поверхности образуется пузырьки газа *- при 0*136 агара в виде обильной пош* яри 0,1# - в толще среда* Реакцию можно

- 5 -

сор^астить с определением способности роста при 42°С, но учитывая, чтр некоторые НФЫ не способны расти при этой температуре дот продуцировать свободный азот, необходимо дублировать цосев С- иййубацкаЗ ДРД 30-35°С* Выделение свободного азота в более ранние сроки (через 4-5 часов после посева, но не лозка) можно определить, используя феномен "раскаленной пахли", погрузсение которой в среду вызывает интенсивное осрободдение азота в-'вядэ пузырьков газа иди пеннзс на поверхности среды*

2,3* Оксидация углеводов (мальтозы, ксилозы, сахарозы) и дру*-гах О-оодержяцнх компонентов* Пептон 2,0; хлорид натрия 5,0 г; углевод 2,0 г; 1,6$ щелочной раствор бромх яшмового сжааго 6,0 мл; цгар 12,0 ^ | вода до 1000,0 мд*, pH 7,2-7,4* Посла стершизацпх лра 0,5 атм 15 мин, разлить ореду в чаше. Посев макрокадонляш i 12-18), жкубация при 35°С 18-80 часов или 30°С до 2 суток* При определении оксидации дактодн концентрацш) последней увеличивав до 10$ и длительность нннубацпи до 2-7 суток при 25°С ж до 4-7 суток при 30°С.

2.4. Определение желатииазиой активности. Питательный агар 1,2$ (здсрподтонный цлш ^тбричный порошковый) 1000,0 мд; желатин 200,0 г; стерилизация при 0,6 атм 15 мин, разлить в чшки нетолстым слоем (не более 1б ш в чашу). Посла застывания среды ее наверх-нооть залить тонким слоем 2$ агара на диотиялнрованьой вода. Посев ишфшилоштшс (бляшками) в количества 12-18. Инкубация при 35°С 1-2 суток жди при 30°0 2-3 суток. Положительный результат - a alia педутавния вокруг колоний*

2.5# Определение продукции фен аз ни a (cue о и пигментов - щкоцра-ыина, шюрубдал, изданина и др.) (среда 1Синг-А)_# Пептон 20,0 г; агар 12,0 г; глицерин 10,0 г; сульфат калин 10,0 г; хлорид магния

Во всех случаях, при отсутствии специального указания, применяется агар-агар, но Не сухой питатаЛьвыЙ отар фабричного произведет^ ва*

- 6 -

1,4 г; дода до 1000,0 мд.,    7,2.    Посев    ышфоколоншшн    на чаш-

кях. Инкубация Э5°С 18-24 часа. Продукция феяазинов разных оттенков, от бурого (сочетание рубрина с цианином) до отчетливо зеленого или красного, в зависимости от преобладания того ели иного феаазлна. Пиомеланш может проявляться в ввде темнокорпчневого _гилн черного окрашивания, но феномен наступает обычно поздно (иногда на 7-14 сутки).

2*6. Определение утилизации С и N содержала* Соединенно. Рехтячавт два типа обменных процессов, свойственных ПИ. При первой углерод а азот утилизируктся микроорганизмом в среде ограниченного минерального составе, лрн втором базовая среда должна быть полнощ вой, содержать те или иные факторы роста, высоко питательные вещества ю нативные животные белки*

2*6.1. Состав базовой минеральной среды ограниченного состава может быть различиям, от сложных наборов большого количества разных солей до простых, содержали* неШогие органогены, типа сред Козера или Симмонса* Может бить рекомендован аледушлй комплекс солей: Оды оз вмещенный фосфвт калия 1,5 г; сульфат магния 0,02 г;

ajuirfru/A Q'^г 1

хлорид натрия 0,5 г^агср 1,2 г; 1,6? щелочной раотвор броигкмодоьо-го синего 0,5 т; вода 1000,0 ил. После растворения стерилизовать прж 1,0 атм 20 мин, хранить в холодильнике, применять по мере надобности, прибавляя разные источники углеродного питания к 100,0 ид базовой среда; по 5 та стерильных водных растворов 10? глгкозы,

6,0? ацетата натрия или цитрата натрия, 10? различных углеводов. Этанол прибавлять перед разливкой в чашки в количестве 1,2? для определения кнелотообразования жди 0,3 мл для определения утилизации. Посев разных шташов макроколониями (бдпгшшя) fro 12-18-24 в чешке.

2.6.2. Базовая среда для второго типа метаболизма может быть различной для разных НФМ. Основная минеральная база аналогична ре-

- 7 -

командуемой в п.2*6.1* Дополнительно гогут оыть введены метионин (0,2-0,3#), дрокжевоЛ экстракт (0,3$), различные ашнокясяоты (танке до 0,6$); некоторые НФМ нуждаются в полноценных средах» типа сердечно-мозгового настоя, иногда в нативных животных белках - крови, кровяной сыворотке в обычно принятых для таких сред концентрациях. Подбор для каждого НЙД необходимых компонентов сложен, затрудняет процесс идентификации; драла ограничиться констатацией отсутствия роста и изменения реакции среды в минеральной сроде с глюкозой для сахароеттов (кислая реакция в положительном случае) и с ацетатом натрия для щелочвобразователэй (щелочная реакция в положительном случае),

2.?, Определение уроазной активности, Может быть использована синтетическая минеральная среда (п.2,6.1*) о вамэыол источника азотного питания мочевиной в количестве 0,155 t уменьшением содержания глшоэы до 0,1$. Определение в папках посевом шкроколшш; да. При интенсивно* уреазноЗ реакции щелочение подлежащего сдоя среды наступает ут через 5-4 часа после посова, в умеренной реакции - через 16-18 часов. Целесообразно после 3—4 часовой щекубацни црж 30-35°С чашей до с^юдущого утрэ оставлять при комнаткой температуре*

2.6, Определение металлического блеска, Сухой питательный агар порошковый Дагестанского производства 3060; пептон 10,0; вода до 1000,0 г. Поело стерилизации при I ахи 20 мин внеоти 100,0 ид отершсьного снятого молока* 30,0 ил IQjt водного раствора хлорида трйфенжлтетрезода (ТОО (самостврилизуется при кодаагиой температуре в течошш 2-3 оутак), смешать и раздать в чамвд* по 20-25 ид. Посев инкроколонтш. Доело шкубацян при 35-37°р в точение 22-24 часов на поверхности ипкроколоаий появляются золотистые вкрапления. При данном составе среды - реае воя поверхность шкроколоншг покрыта золотистым надетой. При отрицательной результате следует