госкгагассЕР. по швчвсш средства борьбы с вреде елям

БОЛЕЭНЯЯ РЛСТВНИ1 й СОРНЯКАМИ ПРВ ШШСЕЙЫС08Е СССР

Ы2Т0ДЗЧЕСШ Ш8АНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ШКРОКОЛИЧВСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОРНАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

часть т-я

Мооюва - 1984

Настоящие методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исслег^вательских учреж-дений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других Министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продукт' х питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических укаАий устанавливается то утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ ХСР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И.

1 лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом упраздним Минздрава СССР.

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ :

Л.Г. Александрова, Д.В. Гиренко, А.А.Калинина (секретарь), М.А. Клисенко (председатель), Г.И. Короткова, Г.А. Хбхоль-кова ( зам. председателя), В.Е. Кривенчук.

325.

"УТВЕРЖДАЮ" Заместитель Главного Государственного Санитарного врача СССР А.И.Зайченко

2799-63_

"12"_кая_1963    г.

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по определению остаточных количеств препарата

вирин-диприон на растительных объектах ИФ-методом

Настоящие методические указания распространяются на определение содержания во внешней среде полиэдров вируса ядерного по-лиэдроза рыжего соснового пилильщика (ВЯП РСП), являющегося действующим началом вирусного инсектицидного препарата вирин--диприон.

I. Характеристика анализируемого пестицида

Вирусный препарат вирин-диприон предназначен для борьбы с личинками рыжего соснового пкдильщика 1-Ш возрастов. Действующим началом препарата является вирус ядерного полиэдроза кишеч-нЬго типа, содержащийся в тельцах-включениях (полиэдрах). Препарат жидкой Формы представляет собой концентрат-суспензию полиэдров в 50£ глицерине, темно-серого цвета с беловатым осадком при отстое, состоящим главным образом из полиэдров. Размер полиэдров колеблется от 0,5 до 4 мк, в среднем 2 мк. Подсчет титра препарата производится по числу полиэдров в I мд в камере Горяева под световым микроскопом и составляет в среднем 1x10 •

I.I. Принцип метода

ИФ-метод выявления остаточных количеств вирусного препарата основан на явлении иммуноФлюоресценц и (Кунс, 1941), широко испольэуемом в медицинской вирусологии дл~ идентификации микроорганизмов. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров ШП РСП) с антите-

ламн, мечеными Флуоресцирующим красителем (ФЙТЦ). Реакция выявляется при наблюдении в люминесцентном -микроскопе в виде специй нческого свечения комплекса антиген-антитело - яркое келто--зеленое свечение полиэдров.

В данной методике используется непрямой вариант метода Кунса, где для выявления комплекса антиген-антитело применяют антиполпэдренную (против полиэдров ВЯП РСП) сыворотку и стандартную, меченую ®ГГЦ_;ослиную сыворотку против глобулинов кролика, изготовленную Институтом эпидемиологии и микробиологии мм. Гамалея г.Москва.

1.2.    Метрологическая характеристика метода

Данным методом можно определить количество полиэдров в субстрате от 1.10^ в мл и более.

1.3.    Избирательность метода

При условии применения качественных гипериммунных антипо-диэдренных сывороток и устранения неспецифического свечения в исследуемых препаратах метод расценивается как специфический и высокочувствительный, а также как экспресс-метод. Метод можно использовать для выявления полиэдров ВЯП РСП на различных объектах окружающей среды при разработке гигиенических нормативов, а также в научных исследованиях при идентификации полиэдров этого вида, при изучении эффективности применения препарата ви-рин-диприон и т.д.

2. Отбор проб

Производят согласно "Унифицированным правилам отбора проб с/х продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определз :ия микроколичеств пестицидов" утвержденным М3 СССР 21.03.1979 Н* 2051-79, Приложение 3 /3.4.1.7.2 - 3.4.7.2.5, способ отбора проб "ОШ" (отбор штук) и "ПД" (отбор по диагонали) различных видов древесной и травяной растительности/.

С целью выявления полиэдров на поверхности объектов проводят смывы с них следующим образом. Пинцетом берут г.з За_::аи*»е

327.

приготовленных стерильных пакетов марлевую салфетку (5x5 см), смачивают ее в Физиологическом растворе (0,15 N К⁵аС1) с pH 7,4 - 7,6, отжимают и тщательно протирают ею исследуемую площадь 100 кв. см (смыв с поверхности плодов, листьев, коры деревьев и проч.). Переносят салфетку в колбу с 100 мл физ,раствора pU 7,6, энергично встряхивают 5 мин, отнимают салфетку пинцетом и удаляют. Смыв Фильтруют через три слоя марли для удаления грубых частиц и центрифугируют 30 мин, при 5 тыс зб/мин, осадок ресуспендируют в I мл дистиллированной воды.

Если проба состоит из мелких объектов (трава, листья, ягоды и проч.) в таком случае готовят навеску 200-300 г, помешает в широкогордые банки, доливают 200-300 мл физ-.раствора с pH 7,4-7,6, энергично встряхивают 10-15 мин, отстаивают 10 мин, надосадок центрифугируют при 5 тыс об/мин 30 мин,- осадок ресуспендируют в I мл воды.

,    х£р    H9rv    п

для дальнейшей работы просмотри температуре +4^иС.

3.    Реактивы и материалы

1.    Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика изготовленаЯинститутом им.Гамалея, г.Москва

2.    Иммунная специфическая кроличья сыворотка против полиэдров ‘ ВЯЛ РСП

3.    Нефлц»эресцирующее иммерсионное масло или диметил-Фтолат

4.    Дистиллированная вода

5.    Фиаиологическ ;й раствор (0,15 М JfcCl) с pH 7,4-7,6

6.    Ацетон,ГОСТ - 2603-71

7.    Мертиолат натрия или борная кислота_#ГОСТ 9656-61

8.    Синька Эванса

9.    Антибиотики - йеницилии, стрептомицин, 5-нитргэксихинолин

4.    Приборы и посуда

I. Люминесцентный микроскоп марки МЯ-2 ли НЗ-З Центрифуга Ц1С-1 и др.

3.    Пипетки градуированные иа 1,0 и 5,0 *д_;ГОСТ 1770-51

4.    Чаяли Петри

5.    Предметные стекла

6.    Пробирки бак*ернологическде

328.

7.    Химические стаканы на 250 мл_;Г0СТ 6236-52

8,    Камера Горяева

5¹ Подготовка к определению

Основными реагентами в данном определении являются - иммунная сыворотка против ядерного полиэдроза рыжего соснового пилильщика, являющегося действующим началом препарата вирусного инсектицида вирин-диприон, а также меченая ФИТЦ сыворотка против глобулинов кролика. Последняя сыворотка изготовляется в институте им.Гамалея Н.Ф. г.Москва. Что касается иммунной сыворотки, то для проведения анализа в СЭС ее можно получить у авторов методик, или у авторов препарата, также Минздрав может заказать ее изготовление в институте им.Гамалея.

Для научных лабораторий, работающих с бакуловирусами,рекомендуется самостоятельно изготовить антисыворотку к полиэдрам из препарата вирин-д прион по следующей схеме.

Полиэдры для иммунизации животных извлекали непосредственно из препарата инсектицида виркн-диприон, можно получать их и из больных гусениц соответствующего вида. Очистку и концентрацию полиэдров вели по В.И.Барановскому в С.А.Бахвалову (1974) методами дифференциального центрифугирования и в градиенте плотности сахарозы. ¹

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывали антибиотиками из расчета 500-1000 ед стрептомицина и пйници-лина и 20 мкг/мл 5-нитрооксихинолина. Перед иммунизацией взвесь стерильно отмывали от антибиотиков, полиэдры ресуспендировали в стерильном физ.растворе. Титр инокулята обычно составлял 1.10^ пдр/мл. Приготовленным антигеном иммунизируют беспородных кроликов массой по 2,5- 3 кг. Высокотитрованные сыворотки получают по следующей схеме иммунизации:    инъекции    проводят    внутренно    триады

с недельным интервалом по 1,5 - 2,0 - 2,5 мл, реиммуниэация через 4 недели внутривенно 2,5 мд. Взятие крови через 10 дней после реиммунизации. Сыворотку хранить с добавлением консерванта /мертиолат 1:10000/ при -20°С, лучше сыворотку лиофилизировать и

хранить при +<*°С. В этих условиях высушенная сыворотка сохраняет активность до 5 лет.

6.    Проведение определения

Хорошо обезжирен ое предметное стекло пометают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 кв.см. Затем на стекло микропипеткой наносят 0,02 мл исследуемой суспензии, равномерно распределяя ее по отмеченной площади. Препарат подсушивают на воздухе, для фиксации опускают в ацетон на 15 мин, после чего окрашивают синькой Званса для гашения неспецифического свечения. Используют синьку Званса в разведении 1:10000 дистиллированной водой. Время обработки препарата синькой 10 мин, затем препарат промывают проточной водой и подсушивают, после чего препарат должен иметь слабоголубую окраску. Затем на препарат наносят антиполиэдренную иммунную сыворотку против ЕЙП РС11, предварительно разведенную 1:10 физ.раствором, помещают на 20 мин при 37°С во влажную камеру, затеи смывают проточной водой, подсудидают на воздухе, после чего наносят ослиную,    ~    меченую ФИТЦ,сыворотку в рабочем разведении,

указанном на ампуле. Выдерживают в термостате при 37°С 20 мин во влажной камере с последующим промыванием в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентный микроскоп. Препарат просматривают под иммерсией, используя иефлуорес-цируюкее масло, объектив 90, окуляр 8.

Полиэдры в препарате выявляются по специфическому яркому желто-зеленому свечению их ободков на общем красноватом фоне.

Контроля: а) препараты, приготовленные по той же схеме, но без обработки специфической иммунной сывороткой; б) препараты, обработанные обеими сыворотками, но заведомо не содержащие выявленных полиэдров.

В контрольных препаратах свечения полиэдров не выявляется.

7.    Обработка результатов анализа

Подсчет числа полиэдров в исследуемом препарате ведется по а. г

Формуле М *------_#    где;    М    -    количество    полиэдров    в    I    мл    He-

у. £

следуемой суспензии (концентрат смыва со 100 кв.см поверхности);

330.

a - среднее число полиэдров в одном квадрате окулярной сетки; & - площадь исследуемого мазка в мм^; у - объем нанесенной на стекло суспензии в мл;

S,~ площадь квадрата окулярной сетки в мм^

Подсчет полиэдров проводят в 100 и более квадратах окулярной сетки. '

Пример: для анализа взяли листья с обработанного препаратом дерева, определили среднюю площадь их поверхности - 100 сьг. Сделали смыв с листьев и обработали его способом, описанным в п.З. Приготовили препарат, покрасили его по непрямому методу Кунса, как описано в п.7. При просмотре препарата в люминесцентном микроскопе подсчитали общее число полиэдров в 150 квадратах окулярной сетки ^    *    320,    отсюда    _{а в} ^ в 2 13

150    *    *

Площадь мазка известна S* *» 20 мм х 20 мм - 400 мы^

Сторона квадрата окулярной сетки равна 0,0062 мм (определили о помощью обьектмикрометра), т.о. площадь квадрата окулярной оет-ки Jf, - (0,0062)² = 0,00004 им² Объем нанесенной на стекло суспензии у « 0,02 мл

air*    2.13 . 400    о

Таким образом X ----- »    1,1    .    10

У ’.Г,    0,02 „ 0,00004

т;е; на 100 кв. см обследованной площади приходится 1,1 .. Ю⁹ полиэдроида I кв. см площади - 1,1 . ДО⁷.

8. Требования безопасности

Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами 1У группы (условно патогенные')

9» Разработчики,

Васильева В.Л., Трусов В.И; - Киевский ним эпидемиологии

н инфекционных болезней нм; Д.В.Громаяевского М3 УССР

347.

СОДЕРЖАНИЕ*

X. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИИ В ВОЗШЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ:

отр.

Агелояа и ситрина.................. 3

Актеллика и пришпида............'. . . .    8

Алвпа........................13

Бен8оилпгюпэтпла и этилового эфипа N-3,4- дяхлор-

фенилаланина........ 17

Беномила и ЕМК.......... 22

Беятаэона......................30

Биопесметрина.....................35

Болстапа.......................40

Боояокота......................48

Бутилкаптакса .......... 52

Бутокагбоксима....................59

Гидрела . '.......................63

ГМК-Na....................... 66

Даконкля...................... 70

Диавиноня, эптама, гамма-изомера ГХЦГ.фенмедедифама,

лекапила.фосфашда и пиразояа..........77

Дигид ~ела...................... 69

Диквата........................93

Зоокука-чпа.....................37

Карбофурана.....................100

Кречетояа......................ХО**

Мепида и 3-хлор-4-метил8тгилина....... X0Q

Метазина и компонентов гярбишщной смеси "карагард" . ИЗ

Митака....................... 118

Офунака............. 124

Пликтрана..................... ^т28

Ратпяданэ..................... Х32

Раунда на..................... Х38

Ровряля ...................... 143

Розалина..................... Х43

Синтетических пиретроидов (амбуп.депис.рипкорд,

сут/;пп'Д':н). *. ......... 154

С томна....................... XGI

248.

стр.

Сумилекса......... 166

Томллона.................... 173

Триморфамида.................. 180

Фекама-трибуфона................ 136

Фталаиа.................... 192

Лропарата 242 и металлилхлорида (MX) ... .    200

Хоотаквкка ................... 206

Эдила..................... 210

П. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРВДЛШЮ нвслмшиюв в ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ,КОРМАХ И ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

Хлороргапическяе пестициды

Методические указания по определению остаточных

количеств гексахлорана (линдэка) в оушеном

картофеле полярографическим методом....... 213

Фосфоропганические пеотипиды

Методические указания по определению дифосв (абата) в продуктах животного происхождения методом тонкослойной хроматографии ....... 218

Методические указания по определению мотафоса, фосфамида и хлорофоса в сушеных овощах и плодах (картофель, морковь, петрушка, яблоки, груши, слива) методами тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии .................. 223

Временные методические указания по определению метилпитрофоса.фенитрооксона и п-нитрокреэола в лесной растительности и почьо тонкослойной

хроматографией .................. 241

Методические указами." по определению трихлорметвфоса-3 и его метаболитов в биоматериале методом газожидкостной хроматографии ............ 252

1

Барановский В.И., Бахвалов С.А. в кн.: "Enpycu насекомых", "Наука", Новосибирск, 1974, 8-1I.